MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEURE ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE D’ORAN ES- SENIA FACULTE DES SCIENCES DEPARTEMENT DE BIOLOGIE Laboratoire de Biotechnologie des Rhizobiums et Amélioration des Plantes Mémoire en vue de l’obtention du diplôme de Magister Spécialité : Amélioration des plantes Option : Sélection Intitulé ; RECHERCHE DE MARQUEURS GENETIQUES LIES A LA TOLERANCE A LA SALINITE CHEZ DES ECOTYPES D’ESPECES ANNUELLES DE MEDICAGO Présenté par : Melle Hammou Bakhta Devant la commission du jury : Président : Pr. BEKKI .A Professeur Université d’Es-Senia Oran Rapporteur : Pr. FYAD F.Z Professeur Université d’Oran Es- Sénia Examinateur : Dr. BENBAYER .Z Docteur Université d’Oran Es- Sénia Examinateur : Pr. AOUES .A Professeur Université d’Oran Es- Sénia Année Universitaire : 2009-2010 Sommaire Remerciement Dédicace Résumer. INTRODUC TION ................................................................................................................. 01 PREMIERE PARTIE : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE Chapitre I : Présentation de la plante .................................................................................... 05 I. 1. Le genre Medicago : Taxinomie, aire de répartition et domestication: ............................... .05 I. 1. 1. Medicago truncatula .................................................................................................. .08 I. 1. 2. Medicago aculeata..................................................................................................... .08 I. 2. Medicago plante modèle pour l’étude des interactions plante- stress ................................. .10 I. 2. 1. Importance des légumineuses cultivées. ......................................................................... .10 I. 2. 2. Le genre Medicago comme modèle génétique................................................................ .11 Chapitre II : Les stress chez les plantes ................................................................................. 15 II. 1. Qu’est qu’un stress ? ....................................................................................................... 15 II. 2. Le stress abiotique ......................................................................................................... 16 II. 3. La perception du stress et les différents types de senseurs................................................. 16 II. 4. Transduction du signal : ................................................................................................... 18 II. 4. 1. Le calcium................................................................................................................ 18 II. 4. 2. La voie SOS ............................................................................................................. 19 II. 4. 3. Les protéines kinases dépendantes du calcium (CDPKs) ........................................... 19 II. 4. 4. Les vois de MAPKinas ........................................................................................... 19 II. 4. 5. Les phospholipases ..................................................................................................... 20 II. 5. La salinité ........................................................................................................................ 21 II. 5. 1. Origine de la salinité ................................................................................................. .22 II. 5. 1. 1. Origine primaire ............................................................................................... .22 II. 5. 1. 2. Origine secondaire. ........................................................................................... 22 II. 5. 2. Le stress salin .......................................................................................................... 23 II. 5. 2. 1. Les réponses des plantes au stress. .................................................................. 23 II. 5. 2. 2. Tolérance au stress salin chez le « Medicago ». ................................................. 27 II. 5. 3. Les modifications métaboliques suite aux signaux du stress. .................................... 28 II. 5. 3. 1. Synthèse des protéines. ......................................................................................... 29 II. 5. 3. 2. Synthèse des enzymes........................................................................................... 32 Chapitre III : Les marqueurs isoenzymatiques. .................................................................... 36 III. 1. Définition d’un marqueur ............................................................................................... 36 III. 2. Les isoenzymes ............................................................................................................. 38 III. 2. 1. Les estérases. ........................................................................................................... 39 III. 2. 2. Les peroxydases .................................................................................................... 40 III. 2. 2.1 Définition ......................................................................................................... 40 III. 2. 2. 2. Historique. ......................................................................................................... 41 III. 2. 2. 3. Structure chimique ............................................................................................. 41 III. 2. 2. 3. Localisation et mobilité des peroxydases. ........................................................... 42 III. 2. 2. 5. Rôle physiologique ............................................................................................ 42 DEUXIEME PARTIE : PARTIE EXPERIMENTALE Chapitre IV : Matériel et Méthodes. ...................................................................................... 46 IV. 1. Matériel végétal ............................................................................................................. 46 IV. 2. Protocole expérimental ................................................................................................... 47 IV. 3. Séparation des isoenzymes (estérases et peroxydases) par électrophorèses PAGE : ........ 47 IV. 3. 1. Extraction des estérases et des peroxydases........................................................ 48 IV.3. 2. Préparation du gel pour les estérases et les peroxydases ...................................... 48 IV. 3.3. Condition de migration des estérases et les peroxydases ...................................... 48 IV. 3.4. Révélation des estérases ....................................................................................... 49 IV. 3.5. Révélation des peroxydases .................................................................................. 49 Chapitre V : Résultats et interprétation ................................................................................ 51 V. 1. Résultats relatifs aux estérases ....................................................................................... 51 V. 2. Résultats relatifs aux Peroxydases ................................................................................... 58 V. 2. 1. Changements des profils des peroxydases chez les deux espèces Truncatula et Aculeata.et une population sauvage (inconnue)......................................................................... 58 V. 2. 2. Changements des profils des peroxydases chez la population sauvage de Medicago. .... 62 VI. Discussion .......................................................................................................................... 65 VI. 1. Modification des estérases sous un stress salin. .............................................................. 65 VI. 1. Modification des peroxydases sous un stress salin .......................................................... .71 Conclusion et perspective ....................................................................................................... 77 - Références bibliographiques Au nom de Dieu je dédie ce modeste travail : La mémoire de ma mère, qui M’a appris la patience, la volonté…. Mon père pour ses prières et son sacrifice. Mes sœurs et mes frères AISSAM Mes collègues et amis Et a toutes les personnes qui portent le nom Hammou et Yagoubi Ma profonde gratitude s’adresse en premier lieu à Dieu dont l’aide et l’assistance m’ont permis de suivre ma formation au sein de ce laboratoire afin de réaliser ce travail. Merci au Laboratoire Génétique et amélioration des plantes en nommant sa directrice Madame Fyad-Lameche F-Z pour m’avoir accueillie pendant ces 4 années de travail. Mes remerciements s’adressent également aux différents membres du jury : Monsieur BEKKI .A professeur à l’université d’ES_SENIA d’Oran pour avoir accepter d’honorer la présidence du jury. Madame BENBAYER .Z Docteur à l’université des Sciences d’Oran pour avoir accepter d’examiner ce travail. Monsieur AOUES .A Professeur à l’université d’ES_SENIA d’Oran qui a bien voulue participer au jury en tant qu’examinateur. Merci à Monsieur YAHIA.N collaborateurs au laboratoire de génétique et d’Amélioration des plantes pour m'avoir appris les techniques d’électrophorèse, pour m'avoir soutenue au cours de l'élucidation des mystères peroxydasiques et Pour son aide précieuse durant mes années de thèse. J'adresse mes remerciements les plus chaleureux à Melle Lachheb Fayrouse pour sa première correction de thèse, pour sa gentillesse et pour son amitié, qui s’est muée en fraternité, ainsi que pour tous les moments partagés autour d’un repas de midi ou d’une tasse de thé à discuter de tout et de rien… Je tiens à adresser ma vive reconnaissance à tous mes professeurs de collège, de CEM, de Lycée en particulier Mr Mahdi et Madame Khaldi. Ce travail étant le fruit de nombreuses collaborations et contributions, J’exprime mes remerciements à toutes les personnes et à l'ensemble des membres du laboratoire de génétique et d’amélioration des plantes. Merci encore à ceux que je n'ai pas cité et qui ont également contribué à rendre ces quatre années distrayantes, mouvementées et particulièrement enrichissantes. Je remercie enfin spécialement mes parents, mes sœurs et mes frères pour leur présence et leur soutien immuables dans les moments les plus durs pour tout cela, je leur Témoigne mon affection éternelle. Résumé : L‘Algérie représente l‘une des zones de diversité génétique les plus riches, où l‘on peut recenser une grande variété de milieux agro-écologiques ; néanmoins la caractéristique aléatoire des précipitations annuelles et les stress abiotiques imprévisibles et sévères viennent souvent aggraver la situation de l‘agriculture algérienne, qui connaît un déficit fourrager énorme, et les animaux sont souvent soumis à des périodes de disettes alimentaires fréquentes. Cet état de fait a amené les décideurs à opter pour augmenter le nombre de forages, donc une sollicitation plus accrue des nappes littorales. La salinisation des sols qui recensée parmi les stress abiotiques représente un facteur limitatif majeur de la production agricole de plusieurs pays méditerranéens, en particulier l’Algérie. Ce qui fait l’objectif de cette étude, c’est l’identification des marqueurs isoenzymatiques en particulier les estérases et les peroxydases liés à la tolérance au stress salin chez des espèces annuelles de Medicago. Les résultats de notre expérimentation montrent des profils isoenzymatiques de peroxydases présentant par rapport aux témoins deux zones avec des variations quantitatives et qualitatives. Le stress salin semble altérer le métabolisme normal de ces enzymes en le retardant davantage chez les écotypes sensibles que les écotypes tolérants. De plus une apparition de nouvelles bandes isoenzymatiques a été mentionné chez les écotypes sensibles que chez les tolérants. De même, les profils des estérases présentant entre deux et trois zones d’activités selon l’espèce, nous remarquons là aussi l’apparition de variations d'ordre quantitatif et qualitatif. Outre de ces variations, une expression différentielle liée au stade de développement de la plante au niveau du témoin est notée, alors que chez les traitées en plus de bandes constitutives, des bandes spécifiques au stress apparaissent. Mots Clés: Stress slain - Medicago - Estérases – Peroxydases. Abstract: Algeria represents one of the richest genetic diversity zones, where one can count a big variety of agro-ecological surroundings; nevertheless the characteristic uncertain of the yearly precipitations and the unforeseeable and abiotic stress comes to aggravate the situation of the Algerian agriculture, that knows an enormous fodder deficit often, where the animals are often submitted to periods of frequent food scarcities. This actual position brought the decision-makers to opt to increase the number of forage, therefore a solicitation more increased of the coastal tablecloths. Salinity in sol is one of the major stress can severely limit crop production of many Mediterranean countries, in particular Algeria. Esterase and peroxidase isoenzymatiques pattern associated with salt tolerance in Medicago were studied in this work. The results show two major zones of peroxidases with quantitative and qualitative variation. We noted the presence of the novels bands exclusively in sensible ecotypes. Esterase activity shows 2 and 3 zone according to the species. Whereas at treated in addition to the bands constitutive the specific bands to the stress appears to different salt concentrations. Key word: Salt Stress - Medicago - Estérases – Peroxydases. ﻣﻠﺨﺺ اﻟﺠﺰاﺋﺮ ھﻲ واﺣﺪة ﻣﻦ أﻏﻨﻲ اﻟﻤﻨﺎﻃﻖ ﻣﻦ ﺣﯿﺚ اﻟﺘﻨﻮع اﻟﻮراﺛﻲ اﻟﻨﺒﺎﺗﻲ .ﻏﯿﺮ أن ﺗﻘﻠﺒﺎت اﻟﻤﻨﺎخ و ﻧﺬرت اﻷﻣﻄﺎر ﺗﻌﺘﺒﺮ ﻋﻮاﻣﻞ ﻗﺎﺳﯿﺔ ﻋﻠﻰ ﻣﺮدود اﻹﻧﺘﺎج اﻟﻨﺒﺎﺗﻲ اﻟﺠﺰاﺋﺮي و ﺑﺎﻟﺘﺎﻟﻲ ﻧﻘﺺ اﻟﻌﻠﻒ اﻟﺤﯿﻮاﻧﻲ أﺣﯿﺎﻧﺎ. اﻟﻤﻠﻮﺣﺔ ھﻲ اﺣﺪ اﻟﻌﻮاﻣﻞ اﻟﺘﻲ ﺗﺆﺛﺮ ﻋﻠﻰ اﻟﻤﺤﺼﻮل اﻟﺰراﻋﻲ ﻓﻲ ﺑﻠﺪان اﻟﺒﺤﺮ اﻷﺑﯿﺾ اﻟﻤﺘﻮﺳﻂ ﺧﺼﻮﺻﺎ اﻟﺠﺰاﺋﺮ ،ھﺬا ﻣﺎ ﺟﻌﻠﻨﺎ ﻧﻘﻮم ﺑﮭﺬا اﻟﺒﺤﺚ ﻹﯾﺠﺎد ﻋﻼﻗﺔ ﺑﯿﻦ ﻧﻮﻋﯿﻦ ﻣﻦ اﻻﯾﺰواﻧﺰﯾﻤﺎت ) اﯾﺴﺘﺮاز و ﺑﯿﺮو ﻛﺴﯿﺪاز( و ﺑﯿﻦ درﺟﺔ ﺗﺤﻤﻞ ﻧﺒﺎت اﻟﺒﺮﺳﯿﻢ ﻟﻠﻤﻠﻮﺣﺔ. اﻟﻨﺘﺎﺋﺞ أﻇﮭﺮت أن ھﻨﺎك اﺧﺘﻼف ﻛﻤﻲ و ﻧﻮﻋﻲ ﻣﺮﺗﺒﻂ ﺑﯿﻦ إﻧﺘﺎج ھﺬﯾﻦ اﻟﻨﻮﻋﯿﻦ ﻣﻦ اﻷﻧﺰﯾﻤﺎت و ﺑﯿﻦ درﺟﺔ ﺗﺮﻛﯿﺰ اﻟﻤﻠﻮﺣﺔ. ﻛﻠﻤﺎت اﻟﻤﻔﺘﺎح :اﻹﺟﮭﺎد ﺑﺎﻟﻤﻠﻮﺣﺔ – اﻟﻔﺼﺔ– اﺳﺘﺮاز -ﺑﯿﺮوﻛﺴﯿﺪاز . Introduction Introduction : L’amélioration des plantes se définit comme la recherche des meilleures voies permettant de réaliser, à partir d’une constitution imparfaite, une structure génétique adaptée aux critères et aux besoins des populations humaines (Demarly, 1977) cité par Baudoin (1995). Cette amélioration des plantes pour la tolérance et/ou la résistance aux stress abiotiques, dans le but d’augmenter, de stabiliser la productivité des plantes cultivées, et d’en élargir leur culture aux régions marginalisées, a vu un succès indéniable à travers les techniques conventionnelles d’amélioration. Au delà de la sélection classique, différentes techniques biotechnologiques peuvent être utilisées pour améliorer la tolérance ou la résistance aux stress environnementaux. L’on sait que la faiblesse des superficies et de la production fourragère et pastorale, ainsi que les périodes de disettes alimentaires constituent des obstacles majeurs au développement de l’élevage des ruminants en Algérie. Citées comme solution les luzernes, de par leur facilité d'utilisation, assurent l'amélioration de la flore et de la jachère et entrent en rotation avec les céréales grâce à leurs graines dures (Abdelguerfi, 1987). En effet, elles permettent l'enrichissement du sol en azote, sa protection contre l'érosion et l'amélioration de ses propriétés physico-chimiques en rétablissant les réserves de matières organiques disparues. Cependant, la production de semences constitue un frein à l'utilisation des luzernes annuelles au niveau des jachères et des parcours. L’Algérie se trouve parmi les pays qui présentent un besoin réel en fourrage. Le remplacement de la jachère par une culture fourragère assurera sans aucun doute une meilleure intégration de l’élevage à l’agriculture. Hormis le rôle de fixation de l’azote atmosphérique, ces espèces possèdent un système racinaire très puissant qui permet l’utilisation des éléments fertilisants sur une profondeur rarement atteinte par d’autres 1 Introduction cultures. De ce fait, la luzerne est considérée comme une culture améliorante de la structure et de la texture du sol (Amouri, 2006). Chaque année, les surfaces perdues à cause de la salinité des sols varient autour de 20 millions d'hectare dans le monde. Ainsi, ces surfaces sont passées de 48 millions à 265 millions d'ha de terres agricoles touchées par la salinité et aujourd’hui, les surfaces agricoles affectées dans le monde seraient de 340 millions d'ha soit 23% des terres cultivées dans le monde (Cheverry, 1995). Selon Szabolcs (1994), un milliard d’ha est menacé dont 3,2 millions d’ha en Algérie (Belkhodja et al., 2004). Il est avéré que la salinité constitue l’un des stress abiotiques des sols les plus répandus au niveau de la planète limitant fortement leurs rendements (Khales et al., 2006). Par conséquent, l’emploi de cultivars de Medicago tolérant le stress salin présente un avantage d’autant plus viable du point de vue technico-économique. Le genre Medicago est un genre qui renferme 34 espèces annuelles et 21 espèces pérennes. Ces dernières présentent un intérêt agro-économique du fait de leur excellente qualité fourragère et de l’enrichissement de la fertilité du sol qu’elles assurent (Lalaoui-Kamal et al., 1997). C’est ainsi que dans le but de valoriser les ressources phytogénétiques en Algérie, la connaissance des espèces à intérêt fourrager et pastoral représente une préoccupation essentielle (Abdelguerfi et al., 1988). Au cours de ces dernières décennies, ces propriétés ont trouvé des applications agronomiques notamment dans la pratique des assolements légumineuses-Blés. C’est dans une telle perspective qu’en Algérie, l’institut de développement des grandes cultures (I.D.G.C.) s’intéresse à la recherche de cultivars adaptés à nos régions principalement semiarides ou les hivers sont rigoureux et où les sols sont souvent salés. C’est dans le but de valoriser les luzernes sauvages d’Algérie que des travaux portant sur leur écologie et sur des essais de sélection d’écotypes locaux ont été réalisés par plusieurs auteurs (INA collectif, 2 Introduction 1974; Adem, 1974; Abdelguerfi, 1976, 1978). La première évaluation génétique des « médics » à l’échelle nationale est réalisée en utilisant les marqueurs iso-enzymatiques comme moyen d’identification et de caractérisation génétique (El mousadik, 1991). L’objectif de cette étude est d’identifier les marqueurs isoenzymatiques impliqués dans la tolérance d’espèces du genre Medicago à un stress salin modéré et d’évaluer la diversité génétique existant entre les espèces étudiées grâce à ces marqueurs. Pour cela, il a été convenu d’opter pour l’approche d’analyse de l’expression des peroxydases ( PERs) et des estérases ( ESTs). 3 Partie I : Revue bibliographique Généralité sur le Medicago Chapitre I : Présentation de la plante I. 1. Le genre Medicago : Taxonomie, aires de répartition et domestication : La plupart des espèces du genre Medicago sont connues depuis le XVIéme siècle, ainsi dans « species plantarum » plus de 9 espèces sont décrites dont certaines avec plusieurs variétés botaniques. Plusieurs travaux importants réalisés au cours du XIXéme siècle, mais mal reliés entre eux, ont abouti à une description complète du genre Medicago menant à un grand nombre de synonymes. Un premier effort de synthèse – relativement incomplet – a été effectué par Urban (1872). Ce n’est que vers le milieu du XXème siècle que ces espèces ont été réellement étudiées. Aujourd’hui encore, des homonymies ou ressemblances peuvent prêter à confusion et plusieurs limites d’espèces sont incertaines. Le genre Medicago appartient à la famile des Fabaceae, sous famille des papilionoideae. Il est proche des genres Melilotus et Trigonella, ainsi Medicago radiata L. est placée par certains auteurs dans le genre Trigonella. Les caractéristiques principales du genre Medicago L. (1754), peuvent être ainsi résumées : plantes annuelles ou pérennes, herbacées ou arbustives, possédant une corolle papilionacée constituée d’un étendard, de pétales formant deux ailes libres, d’une carène formée par les deux pétales inférieurs soudés ; neuf étamines soudées forment la colonne staminale, une dixième étamine est libre. La corolle et la colonne staminale constituent le dispositif de déclenchement de la fleur, caractéristique du genre, retrouvé chez les espèces autogames. Le calice est formé de cinq sépales soudés. Les feuilles sont trifoliées non terminées par une vrille. Le stipule est collé au pétiole. Les inflorescences pédonculées portent de 20 à 30 fleurs libres. (Prosperi M, 1995). Ce genre comprend des espèces diploïdes, tétraploïdes, exceptionnellement hexaploides (M. cancellata, M. saxatilis et certaines populations de M. arborea). Le nombre chromosomique de base est de 7 ou 8. Les 5 Partie I : Revue bibliographique Généralité sur le Medicago ouvrages de références sont peut nombreux, on peut en citer deux : Negre (1956), Lesins et Lesins (1979). D’après Lesins et Lesins (1979), les formes les plus anciennes auraient été pérennes, probablement ligneuses, préférentiellement allogames. Les formes annuelles se seraient différenciées, il y a 6 à 7 millions d’années, au Miocène, à l’occasion des transgressions marines du bassin méditerranéen. L’évolution du genre s’est accompagnée de modifications morphologiques et biologiques. Les formes annuelles sont strictement autogames, très souvent diploïdes et ont généralement des graines plus grosses (poids de 1000 graines supérieures à 4g) que les espèces pérennes (pois de 1000 graines de 2 à 3 g) avec néanmoins des exceptions notables. Les aires d’origine de toutes les espèces du genre Medicago sont « le croissant fertile », recouvrant les pays ou régions actuelles de Turquie, Iran, Irak, sud du Caucase et le pourtour méditerranéen. Ces espèces ont ensuite conquis l’ensemble de la zone méditerranéenne et les steppes avoisinantes (voir Fig. 1). Au cours du XIXème siècle, elles ont ensuite envahi d’autres parties du monde, en particulier les continents américain et australien à l’occasion des différents courants de colonisation humaine. 6 Partie I : Revue bibliographique Généralité sur le Medicago M Truncatula M Littoralis M Italica Figure 1. Distribution du genre Medicago truncatula, Medicago littoralis et Medicago italica par pays de provenance d’après Delalande, 2007. 7 Partie I : Revue bibliographique Généralité sur le Medicago I.1.1. Medicago truncatula : C’est une espèce de taille intermédiaire, 60 cm maximum, poilue, à port variable, souvent prostrée, présente sur des sols lourds, marneux ou argileux. L’inflorescence porte de 1 à 5 fleurs. Les gousses sont cylindriques, en forme de tronc, glabres, très dures, à spires jointive et serrées, aux épines recourbées, souvent perpendiculaires au plan des spires ( Fig. 4) . Elles contiennent de 3 à 12 graines. Le poids de 1000 graines varie de 3.3 à 6 g. C’est une espèce diploïde (2n=16). M .truncatula est une espèce localisée principalement dans les zones méditerranéennes chaudes et de basse altitude. On peut la classer parmi les espèces colonisatrices (Cockos et al., 1980). Elle présente une adaptabilité et une variabilité importante vue la gamme de milieux dans lesquels elle évolue. Depuis quelques années, deux espèces-modèles, Medicago truncatula et Lotus japonicus suscitent un intérêt croissant sur la scène internationale. De nombreux laboratoires, les utilisent pour étudier divers aspects des interactions plantes-microorganismes. M. truncatula est plus proche d'un point de vue phylogénétique de la plupart des légumineuses cultivées. En Europe : elle fait partie du groupe des Galégoïdes qui contient les tribus des Trifoliées (luzernes, trèfles) des Viciées (pois, féveroles, lentilles, vesces) et des Cicerées (pois chiches)… Par ailleurs, aux USA, des institutions comme la NSF, l'USDA, et la Noble Fondation ont opté pour M. truncatula comme modèle. C’est ce qui a axé notre choix sur M. truncatula comme légumineuse-modèle. I.1.2. Medicago aculeata: Cette espèce ne diffère essentiellement des autres variétés que par les gousses, munies sur leur suture d’aiguillions très courts, inégaux, un peu épais, sans tubercules ; elles ont d’ailleurs la même forme, roulées cinq à six fois sur elles-mêmes, un peu comprimées à leur deux extrémités, le poids de 1000 graines est élevé (souvent supérieur à 8 g) (Prosperi M, 8 Partie I : Revue bibliographique Généralité sur le Medicago 1995), les fleurs sont aussi plus nombreuses, réunies au nombre de trois ou quatre à l’extrémité d’un pédoncule plus long que les pétioles. Les folioles sont en ovale renversé, un peu rhomboïdales, quelque fois plus allongées, les stipules dentées et un peu ciliées à leur base ; les tiges très anguleuses, légèrement pubescentes et rameuses. Figure 2. Différents modèles de la gousse du genre Medicago (Prosperi, 1995) figure 4. Medicago Truncatula (feuilles, gousses, fleur) (Besancon, 2009) Figure 3. Medicago Aculeata (feuilles, gousses, fleur) (forage.okstate, 2008) 9 Partie I : Revue bibliographique Généralité sur le Medicago I. 2. Medicago plante modèle pour l’étude des interactions plante-stress environnementaux : I. 2. 1. Importance des légumineuses cultivées Les légumineuses (Fabaceae) sont définies par leur structure florale spécifique, la cosse de leur fruit et surtout par l'aptitude (88% des espèces examinées) à former des symbioses fixatrices d'azote avec les bactéries de la famille des Rhizobiaceae (de Faria et al., 1989). Ces plantes viennent au deuxième rang après les graminées pour la satisfaction des besoins alimentaires de l'homme (Graham et al., 2003). Les légumineuses comptent 670 à 750 genres et 18000 à 19000 espèces différentes (Polhill et al., 1981). Elles comprennent d’importantes espèces à graines, de pâturage et forestières. Au niveau mondial les légumineuses à graines et de fourrage occupent près de 180 millions d’hectares représentant 12 à 15% de la surface des terres arables (F.A.O. 2007). D’une part les légumineuses à graines couvrent 33% des besoins humains en protéines alimentaires. Cette part est fournie, essentiellement, par les cultures du haricot, petit pois, pois chiche et fève (Vance et al., 2000). Les graines de ces légumineuses contiennent généralement 20 à 30% de protéines et sont particulièrement riches en Lysine (acide aminé essentiel pour la croissance). Elles sont, de ce fait, complémentaires des profils nutritionnels des céréales (Duranti et al., 1997), et représentent les principales sources de protéines dans les pays en voie de développement et dans les régions subtropicales. Parmi les légumineuses, le soja (Glycine max) et l'arachide (Arachis hypogea) fournissent plus de 35% des besoins mondiaux en huiles végétales (F.A.O. 2007). D’autre part, Les légumineuses fourragères, telles que la luzerne (M. sativa) et le trèfle (Trifolium spp.) constituent une base importante de l’alimentation des productions animales laitières et à viande en raison de leur faible coût, et de leurs qualités nutritives (richesse en 10 Partie I : Revue bibliographique Généralité sur le Medicago azote, énergie et fibre) améliorant la production de viande et de lait dans le monde (Russelle 2001), vu leurs richesses en protéines, fibres et énergie. Enfin, les espèces ligneuses ont également montré une aptitude à séquestrer le carbone, ce qui suggère aussi la possibilité de les utiliser pour s'opposer à l'augmentation du taux de dioxyde de carbone dans l'atmosphère (Resh et al., 2002). Par ailleurs, outre les bénéfices qu’elles entraînent pour l’alimentation et l’environnement, les légumineuses peuvent être utiles dans diverses industries alimentaires (lait et dérivés, pain, tourteau) et chimiques (plastique biodégradable, huile, bio-diésel, colorants, gomme, textile, papier…) (Graham et al., 2003). Plusieurs légumineuses ont été utilisées dans l'industrie pharmaceutique (Duke 1992; Kindscher 1992), en effet, les isoflavones du soja et d'autres légumineuses ont été pressenties pour diminuer les risques de cancer et les effets du cholestérol (Kennedy 1995; Molteni et al. 1995). Bien qu’importantes sur les plans économique, écologique et industriel, les légumineuses cultivées présentent des caractéristiques biologiques qui retardent leur amélioration génétique. Elles possèdent en général un grand génome, sont souvent polyploïdes et leur transformation par Agrobacterium est délicate voire impossible. C’est pourquoi, il a été décidé d’identifier une espèce légumineuse modèle qui serait plus facile à manipuler et à étudier, et qui permettrait, via sa synthénie avec les légumineuses cultivées, d’accélérer les recherches fondamentales et l’amélioration génétique concernant les traits agronomiques d’intérêt : c’est le genre Medicago truncatula. I. 2. Le genre Medicago comme modèle génétique : Les luzernes annuelles ou « médics » dont la culture a été développée par les australiens dans le cadre du "ley farming system" (système céréale-médics), semblent constituer à cet égard une solution intéressante (Puckridge et al., 1983). Diverses tentatives d’implantation de ce système (Halse, 1993) ont été entreprises en Afrique du Nord (Doolette, 1980. ; Jaritz et 11 Partie I : Revue bibliographique Généralité sur le Medicago Amine, 1993 ; Maatougi, 1993). Une dizaine d’espèces parmies les 55 espèces de Medicago recensés par Lesins & Lesins (1979) sont cultivées, la plupart sont présentes dans les pâturages ou parcours, notamment méditerranéens. La plus connue est sans conteste la luzerne cultivée (Medicago sativa L.). Cette espèce constitue, avec les trèfles la principale ressource en légumineuses fourragères. Elle est cultivée dans le monde entier : dans les années 1980 on comptait plus de 33 millions d’hectares dont la majorité aux Etas Unis (13 millions d’hectares) et en Europe (8 millions d’hectares) (Hanson et al, 1988). Le rôle agricole des espèces annuelles du genre Medicago a été reconnu dès les années Trente quand Trumble et Donald (1938) ont recommandé la culture de Medicago truncatula sur les sols calcaires de l'Australie du sud-ouest. Dans cette région, les medics ont été utilisées en rotation avec les céréales et ont eu un grand impact sur la production agricole (Cocks et al., 1980). Medicago truncatula est actuellement une plante modèle pour la génétique moléculaire . Historiquement, le choix de Medicago truncatula résulte d’un programme INRA (1985-1986) dont l’objectif était de définir une espèce modèle à l’intérieur du genre Medicago, afin de l’associer à Shinorhizobium melilloti, le microsymbiote bien étudié de la luzerne et constituer ainsi un système symbiotique modèle plante-bactérie. En outre elle présente, comme Arabidopsis une grande facilité de culture et un petit génome (Wollmen F-A 2004) d’environ 500 méga-bases/ cellule, c'est-à-dire trois à quatre fois supérieure à celle de Arabidopsis thaliana et équivalente à celle du riz. La biodiversité de l’espèce M. truncatula est caractérisée par une forte variabilité morphologique et génétique intra et inter populations et par une importante homozygotie au niveau individuel. Cette plante a été proposée comme légumineuse modèle (Barker et al., 1990; Cook 1999) en raison de ses nombreux atouts aux niveaux de la biologie, de la génétique et des différents outils génomiques qu’elle offre (Huguet et al., 1996; Young et al. 1995). De plus, 12 Partie I : Revue bibliographique Généralité sur le Medicago Medicago truncatula présente une grande synthénie avec beaucoup de légumineuses cultivées tels que le pois et la luzerne pérenne (Zhu et al., 2005), permettant ainsi le transfert des acquis sur cette plante modèle vers ces légumineuses. Ces avantages sont mis à profit pour des études de génomique fonctionnelle et structurale en vue de l’identification des gènes agronomiques intéressants, ainsi que l’étude des interactions légumineuses-agents pathogènes et symbiotes (Cook 1999, Cook et al., 2000). 13 Chapitre II/ revu bibliographique le stress chez les plantes Chapitre II : Le stress chez les plantes Les plantes sont souvent confrontées à des conditions environnementales défavorables qu’on peut dénommer ‘stress’ et qui ont pour conséquence une diminution de la croissance. Tous les stress impliquent des réactions de signalisation capables d’aboutir à la mise en place de défenses ou de déclencher une mort cellulaire programmée. II.1. Qu’est qu’un stress ? Le mot stress est apparu autour de 1940. Il s’agissait d’un mot anglais, employé en mécanique et en physique, qui voulait dire «force, poids, tension, charge ou effort». Le français Claude Bernard fut le premier à dégager une notion physiologique du stress en 1868. Selon lui, les réactions déclenchées par le stress visent à maintenir l’équilibre de notre organisme. L’ensemble de ces réactions internes a été nommé homéostasie par le physiologiste américain C.W. Bradford (1915), à partir du grec « stasis » (état, position) et homoios (égal, semblable à). Il y inclura en outre la notion de stress. Le lien stresshoméostasie-adaptation va perdurer jusqu'à nos jours et les recherches menées concernant ces processus sont à la base d’une littérature abondante. L’association de ces trois notions constitue l’approche biologique du stress et permet notamment d’expliquer dans certaines limites, l’adaptation à l’environnement, et donc au maintien de la vie (Roeder, 2006). Selon Wang et al., 2001, les stress se traduisent chez les plantes par des changements morphologiques et moléculaires qui affectent leur croissance et leur productivité. D’une façon plus générale, on peut dire qu’au niveau cellulaire, un stress est causé par la variation d’un paramètre environnemental qui entraine la mise en place des mécanismes de régulation de l’homéostasie. 15 Chapitre II/ revu bibliographique le stress chez les plantes II. 2. Le Stress abiotique : Lorsque les conditions environnementales sont susceptibles de provoquer chez une espèce végétale une réduction de la croissance des individus ou une augmentation du taux de mortalité de la population, ces conditions peuvent être assimilées à des conditions stressantes (Tal, 1984). Le stress peut être induit par une substance chimique ou une contrainte physique, de manière réversible ou permanente, selon que les altérations provoquées dans ces conditions disparaissent ou non, après retour à des conditions de croissance normale (Chrétien, 1992). En effet les plantes se trouvent rarement dans des conditions environnementales optimales, mais elles se trouvent souvent dans des conditions extrêmes de potentiel hydrique, de température, de salinité ainsi que d’autres facteurs qui amènent les organismes à la limite de la survie (Hopkins et al., 2003). Les stress abiotiques sont connus depuis longtemps chez les plantes cultivées comme étant des facteurs limitant majeurs de la productivité (Boyer, 1982 ; Balarathinasnasabathi, 2002), ils peuvent également affecter le fonctionnement de la plante en perturbant les flux ioniques (Knight et al., 2001) ou en altérant les parois ou membranes cellulaires (Zhu, 2001 ; Wang et al., 2003). Les organismes qui vivent dans ces habitats ou ces facteurs prédominent, ont développé plusieurs adaptations. II. 3. La perception du stress et les différents types de senseurs : Les conditions du stress abiotique constituent une source de signaux complexes pour les cellules. Un seul type de stress correspond à des variations physiques et/ou chimiques, ces composantes représentant pour la plante des informations différentes. Les cellules végétales ne possèdent pas un récepteur spécifique d’un stress donné, mais plutôt un ensemble de récepteurs qui vent être sollicités par les différentes composantes du stress (Figure 5). 16 Chapitre II/ revu bibliographique le stress chez les plantes Stress secondair: Stress oxidatif Stress osmotique stress Perturbation de l’équilibre osmotique et de l’homéostasie ionique Dommages sur les protéines et les membranes Perception du signal Senseur, canaux Ca2+, HK Transduction du signal 2 nd messagers, MAPK, SOS, CDPK Contrôle de la transcription Facteurs de transcription, (CBF,HSF) Mécanismes de réponse au stress H2O et mouvement d ions (transporteurs) Chaperonnes Activation de gènes Détoxification Osmoprotection Résistance ou tolérance au stress Figure 5 : Représentation générale de réponse au stress chez les plantes (D’après Wang et al., 2003). 17 Chapitre II/ revu bibliographique le stress chez les plantes Parmi les récepteurs identifiés se trouvent les canaux Ca2+. En condition de stress thermique ou salin, il a été observé chez les plantes un influx de calcium dans le cytoplasme. Ce calcium provient soit de l’extérieur de la cellule, soit de stocks internes (Knight et al. ; 2000). Cet influx résulterait d’une activation des canaux calciques induite par les changements structuraux de la cellule. Cette supposition résulte des études de Pieth ( 1999) montrant les liens entre les flux de Ca2+ et la température, considérant que la réorganisation du cytosquelette et la fluidité de la membrane plasmique sont les premiers changements structuraux liés au froid ( Orvar et al., 2000 ; Sangwan et al., 2001 et Wang et al., 2001) cité par ( Roeder, 2006). Les histidines kinases (HK) représentent un autre récepteur du stress identifié chez les bactéries et les plantes. Ces enzymes transmettent un signal externe vers l’intérieur de la cellule par un système de phospho-relais à 2 composants ( Urao et al., 2000). La protéine AtHK1 est fortement suspectée d’être un capteur osmosensible chez A. thaliana ( Urao et al., 1999) II. 4. Transduction du signal : Suite à la perception du stress, le signal crée par les récepteurs doit être transmis à l’intérieur de la cellule. Cette transduction du signal est assurée par les «seconds messagers » qui vont activer des voies enzymatiques assurant le fonctionnement de la cascade de réactions et permettant à la cellule de répondre au stress perçu. II.4.1. le calcium : L’entrée de Ca2+ dans les cellules végétales a été observée en condition de stress abiotique, mais également lors de stress hormonaux (ABA : acide abscissique), biotiques ou lors de processus liés au développement. Cette augmentation transitoire de la concentration interne de calcium est due soit à un influx de calcium extracellulaire soit à une libération des 18 Chapitre II/ revu bibliographique le stress chez les plantes stocks intracellulaires (Knight et al., 2000, Sanders et al., 1999). La libération interne de Ca2+ est contrôlée par des canaux dépendant de ligands. Ces ligands sont les seconds messagers décrits chez les cellules animales ( inositol polyphosphates, ribose ADPcyclique), qui ont une action similaire chez les plantes ( Schroeder et al., 2001). II. 4. 2. la voie SOS : Parmi les voies métaboliques activées par le calcium et participant à la transduction du signal, l’une des plus étudiées à l’heure actuelle est la voie SOS (Salt Overly Sensitive). L’analyse du mutant SOS chez A. thaliana a permis l’identification de 3 protéines (SOS1, SOS2, SOS3), impliquées dans la réponse au stress salin ; le processus impliquant les SOS débute après la fixation de calcium sur la protéine SOS3 qui contient 3 sites de fixation du calcium et un site de N-myristilysation ( Ishitani et al., 2000). II. 4. 3. les protéines kinases dépendantes du calcium ( CDPKs) : Les CDPK (Protéines Kinases dépendantes du Calcium) interagissent directement avec le calcium. Trente quatre gènes codants des CDRKs ont été identifiés chez A. thaliana. Les recherches menées sur ces enzymes ont montré leur implication dans une variété de voies de réponses à différents stress. Par exemple, la surexpression chez le riz (Oryza sativa) d’OsCPKS7 entraîne une augmentation de la tolérance au froid, à la sécheresse et au stress salin ( Saijo et al., 2000). II. 4. 4. Les voies de MAPKinases : La cascade type de la voie des MAPKinases (mitogen actived proteine kinases) est constituée du système MAPKKK-MAPKK-MAPK. Cette cascade est activée soit par une interaction physique directe entre le récepteur et une MAPKKK soit par la phosphorylation de médiateurs externes ou de MAPKKKK intermédiaires, provoqué par ces mêmes récepteurs. Les MAPKKK sont des serine / thréonines kinases qui activent les MAPKK par la phosphorylation de 2 résidus serine / thréonine placés au sein d’un motif conservé ST-X3-519 Chapitre II/ revu bibliographique le stress chez les plantes S/T. Ces MAPKK sont des kinases à spécificité double qui procèdent à) la phosphorylation des thréonines et tyrosines des MAPK sur le motif TXY. Chez les végétaux supérieurs, les MAPKs interviennent également dans la transduction du signal suite à un stress osmotique. Un stress hyper-osmotique peut entraîner l’activation de kinases apparentées aux MAPKs chez le tabac (Usami et al., 1995 ; Tena et al., 1998). Récemment, l’équipe de Munnik (1999) a montré que, chez la luzerne, des concentrations de sels comprises entre 100 et 500 mM entraînaient l’activation de la voie de SIMK (salt stress-induced MAPK). De manière surprenante, des concentrations plus élevées de sels n’activaient non pas SIMK mais une kinase de 35 kDa. Ces travaux révèlent l'existence probable de deux osmosenseurs chez la luzerne, un pour des pressions osmotiques modérées, l’autre pour des pressions osmotiques élevées. En outre, il existe d’autres protéines kinases associées au cytosquelette. Suite au séquençage complet du génome d’A. thaliana, 20 MAPK, 10 MAPKK et 60 MAPKKK ont été identifiées. Des protéines similaires ont été aussi isolées chez d’autres végétaux (Nakagami et al., 2005). Les MAPKKK son les premières kinases intervenant dans la cascade de phosphorylation des MAPKK. Ainsi, il a été confirmé que les kinases de type MEKK sont des kinases dont le rôle est identique à celui de MAPKKK, tandis que celui-ci reste à vérifier pour les kinases de type RAF (MAPK Groupe, 2002). II.4.5. Les phospholipases : Une autre forme de la transduction du signal résulte de l’action des phospholipases. Les phospholipase D (PLD) hydrolysent les phospholipides et produisent de l’acide phosphatidique (PA), jouant ainsi un rôle important dans les mécanismes de la réponse au stress, mais ce rôle varie d’une PLD à une autre. Par exemple, la suppression de PLDα chez A. thaliana entraîne une baisse de la tolérance au froid tandis que sa sur-expression entraine 20 Chapitre II/ revu bibliographique le stress chez les plantes une meilleure tolérance chez ce même organisme (Li et al., 2004). Par comparaison, la suppression de PLDα1 entraîne une meilleure résistance au froid (Weltri et al., 2002). Un certain nombre de travaux montre que la quantité de phospholipides s’accroît généralement dans les plantes exposées au froid. Il en est ainsi, par exemple, pour les tiges de bouleau ou de peuplier (endurcies au froid jusqu’à résister à la température de l’azote liquide), les céréales d’hiver, les semences de céréales ou les racines de luzerne (Willemont, 1979). II. 5. La salinité : Les terrains salés sont fréquents au Maghreb, aussi bien en situation littorale que continentale, (Chotts, Sebkhas) et leur végétation est encore relativement en bon état, même s’ils constituent des pâturages très appréciés pour les ovins et les camelins. Leurs structures s’organisent en fonction de la teneur en sels du sol (Quzel, 2000). La salinité peut entraîner des effets nocifs conséquents en raison de la fixation des chlorures de sodium par les colloïdes du sol. De plus, les sels causent des changements dans la structure du sol (sur sa perméabilité et son aération) affectant directement le développement de la plante (Derradji et al., 2004). Après des siècles d’irrigation et d’exploitations intensives, beaucoup de zones agricoles importantes de notre planète ont souffert des changements de la composition chimique de leurs sols. L’accumulation des sels est l’une de ces modifications. De plus le fort ensoleillement et la faible pluviométrie ont obligé les agriculteurs de ces régions à irriguer en quantité importante et, souvent, avec une eau saumâtre ( Haouala et al., 2007). Les sols salés, fréquemment associés à la contrainte hydrique dans les zones arides et semi-arides du Maghreb, constituent l’un des principaux problèmes pour le développement des plantes. Ils entrainent une réduction des surfaces cultivables et, combinées à d’autre facteurs, ils représentent une menace pour l’équilibre alimentaire de ces régions (Jean et al, 1998, Cheverry 1995). La salinité touche actuellement environ 25 % des terres irriguées et 21 Chapitre II/ revu bibliographique le stress chez les plantes concerne plus particulièrement les zones arides et semi-arides des région méditerranéennes, ainsi que les régions tropicales. Dans ces conditions, la culture des espèces florales, connues pour leur forte sensibilité à la salinité, peut être sérieusement compromise (Maas, 1986). II. 5. 1. Origine de la salinité : II. 5. 1. 1. Origine primaire : Cette salinité provient de l’altération de la roche mère saline par les facteurs d’érosion. La dissolution, par les eaux de ruissellements des roches sédimentaires qui sont riches en chlorures, sulfate et carbonates contribuent ainsi à la salinisation des sols. En effet, l’altération de la roche mère qui fournit les sels responsables de la salinisation primaire est provoquée par l’eau de pluie souvent acide (H2CO3) mais aussi par des agents physiques. (Aubert, 1975) II. 5. 1. 2. Origine secondaire : Un autre processus ne faisant pas appel à la roche mère, peut avoir comme origine soit les eaux d’irrigation qui sont chargées en sels ou une fertilisation chimique excessive (Mouhouche et al., 1999). Par ailleurs, dans un sol irrigué, la remontée capillaire se réalise lors des intervalles entre les irrigations et lors d’une période jachère quand il n’y a pas un mouvement descendant par la percolation d’eau. Selon Eilers et al., 1995, dans la zone d’alimentation qui reçoit des précipitations, l’eau pénètre dans le sol et, si elle n’est pas absorbée par les végétaux, elle atteint les eaux souterraines, celles-ci dissolvent les sels et les transportent dans les zones d’émergence ou l’apport en eau souterraine fait élever la nappe phréatique jusqu'à la frange capillaire telle une éponge, faisant ainsi remonter l’eau à la surface du sol qui s’évapore permettant au sel s’accumuler. II. 5. 2. Stress salin : Le stress salin est défini comme étant le processus pédologique suivant lequel, le sol s’enrichit anormalement en sels solubles acquérant ainsi le caractère salin. ( Eilers et 22 Chapitre II/ revu bibliographique le stress chez les plantes al.,1998). Ainsi, sont appelé sols salés ceux qui sont caractérisés par la présence d’un excès de l’ion sodium échangeable dans le profil (Da Silva, 1982). II. 5. 2. 1. Les réponses des plantes au stress salin : Les plantes peuvent répondre au stress par diverses réactions. Certaines d’entre elles peuvent subir des lésions, ce qui signifie qu’elles peuvent montrer des disfonctionnement métaboliques, d’autre plantes comme les éphémères ne sont jamais confrontées réellement à la sécheresse ou au froid -on dit qu’elles échappent au stress- d’autres plantes possèdent la capacité de résister aux stress par des mécanismes d’évitement ou de tolérance. La tolérance signifie que les conditions qui règnent dans la plante sont en équilibre avec les conditions de l’environnement externe. (Hopkins, 2003). Le stress salin a un accent ionique aussi bien qu'osmotique sur les plantes. Ce stress peut être distingué à plusieurs niveaux (Tester et al., 2003). La racine et l'augmentation de la pousse sont réduites abruptement chez les plantes sensibles au sel et cet effet ne paraît pas dépendre de la concentration des ions dans les tissus en croissance, mais c'est plutôt une réponse à l'osmolarité de la solution externe (Munns, 2002). Les contraintes dues à l’accumulation spécifique de Na+ dans les tissus des feuilles se caractérisent par la nécrose des feuilles les plus anciennes, en commençant par le bout de celles-ci et en progressant vers les marges, puis continue vers la partie basale de la feuille. Les effets spécifiques du Na+ s’ajoutent à l’effet osmotique du NaCl (Munns 2002). Il est rapporté aussi que l’insuffisance des éléments nutritifs dans le sol est due à la haute concentration de Na+ qui réagit réciproquement avec les autres facteurs de l'environnement, telle la sécheresse (Silberbush et al., 2001). La toxicité métabolique du Na+ est en grand partie un résultat de sa capacité à concurrencer l’ion k+, le potassium étant essentiel pour les fonctionnements cellulaires. Plus de cinquante enzymes sont activées par l’ion K+, et le Na+ ne peut pas remplir ce rôle. Ainsi 23 Chapitre II/ revu bibliographique le stress chez les plantes des niveaux élevés de Na+, ou des rapports Na+/K+ importants peuvent perturber divers processus enzymatiques dans le cytoplasme. D’ailleurs, la synthèse des protéines exige des concentrations élevées de K+ , ceci étant dû à la nécessité de la présence de l’ion K+ pour l’adhésion de l’ARNT aux ribosomes ainsi qu’à d’autres aspects du fonctionnement des ribosomes (Blaha et al., 2000). La tolérance des plantes au NaCl varie d’une espèce à l’autre,( jusqu'à 100 mM de NaCl dans l’eau du sol) en effet, les rendements de l’orge, de la canne à sucre et du coton sont peu affectés, mais le maïs, les haricots et la luzerne présentent déjà des limitations importantes dans la production de matière sèche. Les plantes halophiles ou halophytes qui fréquentent les sols salés ou « halomorphes », c'est-à-dire chargé de chlorure de sodium et accessoirement d’autres sels, présentent des adaptations morphologiques «xéromorphoses» et des adaptations physiologiques (Laval-Martin et al., 1995). La plupart des espèces d’intérêt agronomique sont rangées dans le groupe des glycophytes, plantes dites sensibles au sel parce que leur croissance est diminuée en présence de sel dans le sol. Il n’ y a pas de distinction précise entre les concentrations extrêmes de sel tolérées par les plantes de l’un ou de l’autre groupe, bien qu’une frontière arbitraire de concentration extrême en chlorure de sodium de l’ordre de 6g/L soit souvent citée ( Flowers, 1983). Errabii (2006) a étudié l’effet du sel à l’échelle cellulaire chez une variété de canne à sucre. Les résultats obtenus ont montré la présence d’une similitude entre la réponse «in vivo » et «in vitro» de variétés de canne à sucre. Il s’est avéré que le stress salin provoque des altérations et des perturbations très importantes et très sévères chez toutes les variétés aussi bien au stade plante qu’au stade cal. Cette réaction se traduit par une réduction de la croissance (Yang et al 2005), de la teneur en eau ainsi que de la teneur en éléments essentiels 24 Chapitre II/ revu bibliographique le stress chez les plantes tels que le K+ et le Ca2+. En contrepartie, il a remarqué des augmentations importantes en ions toxiques principalement Na+ et Cl- ainsi que de la teneur en proline et en sucres solubles. Afin d’évaluer d’une manière rapide et efficace la tolérance à la salinité de la vigne, on a analysé « in vitro » le comportement de différentes variétés autochtones et porte-greffes vis-àvis du stress salin. À cet égard, des micro-boutures issues de matériel végétal homogène prélevé en plein champ ont été cultivées « in vitro » et soumises durant 45 jours à différentes concentrations salines (0, 20, 50, 80, 100, 150 et 200 mM de NaCl). Les différents paramètres de croissance mesurés concernent la capacité de survie, l’allongement des pousses, la formation des bourgeons et l’aptitude à l’enracinement. Les résultats montrent que la salinité affecte la croissance et le développement de la vigne « in vitro ». Les premiers symptômes du stress (nécroses foliaires) sont apparus après 10 jours de traitement à 80 mM NaCl, et peuvent atteindre un dessèchement total des vitroplants. Par ailleurs, une variabilité de la réponse a été mise en évidence selon le génotype testé et les doses de NaCl appliquées. En effet, les variétés Séjnène et Asli sont relativement plus tolérantes que Saouadi, Sakasly et Razegui, alors que les porte-greffes se sont avérés les plus sensibles par rapport aux variétés testées. En fait, la capacité d’adaptation à la salinité semble être corrélée à la vigueur du génotype. Il semblerait ainsi que la tolérance relative de certaines variétés soit due essentiellement à une composante génétique (Hamrouni et al., 2008). Les travaux d’Almansouri et al., 2001, portant sur l’effet des stress osmotiques et salins sur la germination des graines chez trois cultivars de blé dur (Triticum durum Desf.) différents par leur résistance à la salinité et à la sécheresse, ont montré que les stress d’intensité modérées retardent seulement la germination, tandis que les fortes concentrations de NaCl et PEG réduisent le pourcentage final de germination, et que les effets délétères du NaCl et du PEG sont supérieurs lorsque les stress sont appliqués sur des embryons isolés mis à germer dans des milieux adéquats in vitro que ceux obtenus sur les graines. Ces travaux ont 25 Chapitre II/ revu bibliographique le stress chez les plantes permis de conclure que l’inhibition de la germination par les stress peut ne pas être attribuée à une inhibition du métabolisme des réserves de la graine, et l’effet principal du PEG observé par l’inhibition de l’absorption de l’eau, alors que l’effet nuisible du NaCl peut être lié à l’accumulation des ions toxiques à long-terme. Chez la pomme de terre (salanum tuberons L.) la présence de sel dans l’eau d’irrigation provoque la réduction du diamètre des tubercules, la diminution du nombre d’yeux par tubercule, et des fissurations de l’épiderme du tubercule (Hannachi et al., 2004). La plante selon Polevoï (1989) cité par Laarabi (2006) réagit par : 1. Une augmentation de la perméabilité membranaire et une dépolarisation de son potentiel électrique. 2. Un influx du Ca2+ dans le cytoplasme. Ces ions viennent de la paroi squelettique et des compartiments internes : vacuole, mitochondries, etc. 3. Une acidification du cytoplasme. 4. Un montage de microfilaments. 5. Une accélération de l’absorption d’O2, de la consommation de l’ATP et de la libération de radicaux libres. 6. Une augmentation des processus hydrolytiques. 7. Une activation de la synthèse des protéines du stress. 8. Une activation de la pompe à protons. 9. Une activation de la teneur en éthylène et en acide abscissique. Ces deux substances arrêtent le métabolisme. II. 5. 2. 2. Tolérance au stress salin chez les espèces du genre Medicago Boughanmi et al (2008) ont étudié, chez une espèce fourragère vivace autochtone des oasis tunisiennes (Medicago sativa cv Gabès), l’effet d’un stress salin de forte intensité (150 mM) et de longue durée (4 semaines) sur les aspects ioniques et structuraux des feuilles 26 Chapitre II/ revu bibliographique le stress chez les plantes assimilatrices. Une attention particulière a été portée au complexe phloémien des veines mineures et de la nervure principale respectivement impliquées dans la collecte et le transport à longue distance des assimilas/solutés. Les modifications structurales des cellules de transfert phloémiennes et l’accumulation du Na+ dans le complexe phloémien plaide en faveur de l’implication de telles cellules dans la tolérance à la salinité de Medicaco sativa cv Gabès. La localisation des transporteurs de sodium au niveau de leur membrane élargie sous l’effet du sel confirmerait leur rôle dans la recirculation du Na+. En outre, Zhao et al., (2008) ont montrés que l’activité totale d’ascorbate peroxydase de la peroxydase et de la catalase est généralement augmentés, sous un stress toxique du mercure chez la Luzerne (Medicago sativa). Aussi Rabhi et al., 2007 ont-ils étudié les effets de l'interaction salinité-déficience ferrique sur l'acquisition du fer et l'acidification racinaire induite par le manque de fer chez Medicago ciliaris L à partir de quatre traitements : - C, milieu complet (MC) contenant 30 μM Fe - S, traitement salin (MC) additionné de 75 mM NaCl - D, milieu déficient en fer (MC), contenant 1 μM Fe seulement - DS, traitement combiné, (MC) contenant 1 μM Fe et additionné de 75 mM NaCl. Les résultats ont montré que la croissance et la teneur en chlorophylle des plantes sont beaucoup plus affectées par les effets conjugués de la salinité et de la déficience en fer que par leurs effets individuels, indiquant un effet additif des deux contraintes chez les plantes DS. Ces résultats s’expliquent par l'accumulation du sodium dans les parties aériennes, ainsi que par la limitation de l'acquisition d'éléments indispensables, comme Fe et K en condition de salinité, de déficience en fer et, surtout, en conditions d'interaction de ces deux effets. L'étude a montré également que l'acidification racinaire induite par la limitation en Fe a été fortement réduite en présence du sel. Ce résultat, qui est concomitant avec la diminution de l'absorption 27 Chapitre II/ revu bibliographique le stress chez les plantes .du fer, suggère que l'activité de la pompe à protons racinaire peut être inhibée par le stress salin. Chebouti et al., 2000 avaient déjà noté que quelle que soit la phase où le stress a été imposé, il provoque une chute de la production de gousses et de graines chez les trois espèces de Medicago (M. aculeata, M. orbicularis, et M. truncatula.) étudiées. Mais la réduction a été plus importante lorsque le stress est appliqué lors de la phase floraison (Abbad et al., 2004) que lorsqu‘il est appliqué lors de la phase végétative. II. 5. 3. les modifications métaboliques suite aux signaux du stress : Les stress environnementaux (ou abiotiques), comme la sécheresse, la salinité et les basses températures sont des conditions de stress qui affectent la croissance et le rendement des plantes. Contrairement aux animaux, qui peuvent se déplacer lorsque les conditions de vie ne leur sont plus favorables, les plantes ont développé des stratégies d’adaptation pour répondre aux changements de leur environnement en contrôlant et en ajustant leurs systèmes métaboliques. Ces perturbations entraînent une faible production d’énergie par la phosphorylation et la photo transpiration, une assimilation de l’azote perturbée, et un dérèglement de nombreuses voies métaboliques. Si la concentration en sel excède le niveau de la tolérance de la plante, des perturbations fonctionnelles apparaissent au niveau de la photosynthèse, par effet de sel dans le stroma des chloroplastes qui perturbent le transport des électrons. La glycolyse et le cycle de Krebs sont aussi affectés (Calu, 2006). Les réponses cellulaires et moléculaires des plantes aux conditions de stress ont fait l’objet de nombreuses études. Les mécanismes par lesquels elles perçoivent les signaux environnementaux et les transmettent à la machinerie cellulaire pour activer des mécanismes de réponses adaptées, déterminent chaque jour leur survie. Le NaCl affecterait la croissance et les paramètres de l'impédance par les changements négatifs dans l'activité enzymatique 28 Chapitre II/ revu bibliographique le stress chez les plantes (Roxas et al., 2000), dans la synthèse protéique (Mattioni et al., 1997; Ashraf et al., 1999; Simon-Sarkadi et al., 2002) ou dans la perméabilité cellulaire (Tang et al., 1999). Pour un ensemble d’espèces on constate souvent que les plantes qui peuvent tolérer les environnements modérément salins montrent une plus grande capacité d’exclure l’ion Na+ par la partie aérienne ou au moins les limbes des feuilles elles maintiennent concurremment des niveaux élèves de k+ (ZHU et al., 2001). La plante peut rétablir l’équilibre homéostatique dans le nouvel environnement stressant, l’homéostasie se définit comme la capacité d’autorégulation d’un organisme pour maintenir un état d’équilibre dynamique constant entre les conditions extérieurs et les différentes composantes de son milieu interne, suite à cette adaptation, la croissance peut reprendre et se trouve probablement réduite relativement aux conditions antérieures moins stressantes (Yeo, 1983 et Zhu, 2001) Berthomieu et al., 2003 ont montré chez Arabidopsis thaliana une troisième stratégie à l’intermédiaire entre l’exclusion et l’inclusion : la recirculation. Le Na+ est absorbé et parvient jusqu’aux parties aériennes mais il est aussitôt « re-pompé » et reconduit par les vaisseaux du phloème vers les racines qui peuvent excréter les ions à l’extérieur. II. 5. 3. 1. Synthèse des protéines : Parmi les approches biochimiques visant à décrire, quantifier et analyser les mécanismes de tolérance aux stress chez les plantes, les changements qualitatifs et quantitatifs des protéines sont d’un avantage particulier pour l’amélioration des plantes, en plus de leur utilisation comme marqueurs pour la sélection. L’existence du NaCl dans le sol a toujours préoccupé les agro-biologistes à cause de son action négative sur le rendement des plantes cultivées. Chez les plantes non tolérantes aux sels, le NaCl, en particulier, facilite l’accumulation d’éléments minéraux dans la plante, diminue la teneur en eau de celle-ci et par conséquent baisse l’hydratation des protéines, 29 Chapitre II/ revu bibliographique le stress chez les plantes augmente la viscosité et diminue l’activité enzymatique (Slayter, 1967). Selon Oknina (1953) le NaCl provoque la destruction du contenu cellulaire. L’une des voies protéiques par lesquelles la plante répond au stress, est la production de protéines spécifiques, qui peuvent être impliquées dans l’esquive au stress, dans la réparation des dommages, ou dans la protection des mécanismes cellulaires ; les protéines de cette dernière catégorie comprennent les protéines LEA (late embryogeny abundant)qui s’accumulent pendant la maturation des graines et dont certaines peuvent également être induites dans les tissus végétatifs lors d’un stress hydrique. Ces protéines semblent jouer un rôle de protection contre les stress osmotiques, et il a pu être démontré que certaines pouvaient protéger des systèmes enzymatiques. Cependant, pour la plupart, leur mode d’action est encore peu connu. (Virginie, 2008). La teneur en protéines est plus prononcée chez les écotypes tolérants que chez les écotypes sensibles des jeunes plantes de différentes espèces du genre Medicago (Yahia et al., 2003). Singh et al., 1985 ont étudié l’expression génique induite par le sel dans des cultures de cellules en suspension et dans des systèmes racinaires intacts, les racines étant les premiers organes confrontés aux augmentations de salinité. Il a été observé que des concentrations importantes de plusieurs polypeptides s’accumulent dans des cultures de cellules de tabac soumises à de fortes concentrations de NaCl et de polyéthylène glycol (PEG). Un polypeptide de 26 KDa en particulier est induit à la fois par le NaCl et le PEG. Ce polypeptide a été appelé osmotine, en raison de son apparition dans des conditions de faible potentiel hydrique, ou de chocs osmotiques provoqués par toute une série de facteurs. Une protéine kinase (BGH009N22) dont les homologues du riz ou du blé sont différentiellement régulés par l'ABA (Anderberg et Walker-Simmons, 1992 ; Kobayashi, Y. et al., 2004) cité par (Grimlet, 2004) , voit son niveau d'expression augmenter au cours de la 30 Chapitre II/ revu bibliographique le stress chez les plantes maturation de l’espèce Bergeron. Il est extrêmement surprenant, que l'expression de ce gène soit inhibée chez Moniqui au stade mûr. Cependant, chez le riz, aucun membre de cette famille multigénique n'est contrôlé uniquement par l'ABA. Le niveau d'expression d'un autre isogène (PA269TC1) de cette protéine kinase déposé aussi sur les lames de microarray, augmente jusqu'au stade mi-mûr et chute ensuite. Il est sous-exprimé chez Moniqui au stade mi-mûr et surexprimé dans cette même variété au stade mûr par rapport à Bergeron, ce qui pourrait signifier qu'il est probablement constitutif dans cette variété entre ces deux stades. Les observations sur blé et riz suggèrent que l'expression de ces protéines kinases pourrait être liée au stress hydrique (Grimlet, 2004). Les teneurs en amidon, protéines et huile sont des critères majeurs de qualité. Une variation forte est enregistrée sous l’effet du climat interannuel ou géographique. Par exemple, dans les conditions chaudes et sèches de l’année 2003, François et al., 2003 ont enregistré une teneur supérieure en protéines chez le blé et une diminution de la teneur en huile chez le tournesol. Chez cette espèce, 41% des échantillons ont eu des teneurs en huile qui n’ont pas satisfait la norme de commercialisation. Ces résultats sont une conséquence de la relation négative rendement - teneur en protéines enregistrée à différents niveaux d'investigation (Triboi et al., 2002, 2003). Zid et al., 1991 ont conclu que Le sel induit des modifications qualitatives et quantitatives dans la synthèse des protéines, détectables par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. L’application de cette technique à deux variétés d’orge permet de mettre en évidence une différence de comportement entre la variété sensible au sel (Prato) et la variété résistante (California Mariout). Cette différence se manifeste seulement au niveau des feuilles. Dans ces organes, le sel induit la synthèse de cinq nouvelles protéines : trois d’entre elles sont spécifiques de la variété sensible et les deux autres communes aux deux variétés. Au niveau des racines, six nouvelles protéines sont synthétisées par les deux variétés (Ramagopal, 1987) 31 Chapitre II/ revu bibliographique le stress chez les plantes Tableau 1. Les changements des protéines solubles vis-à-vis de la salinité chez différentes espèces. Espèces réponses au salinité Références Vicia faba diminue Gadallah (1999) Amaranthus tricolor diminue Wang and Nil (2000) Bruguiera parviflora diminue Parida et al., (2002) Pancratium maritimum Khedr et al., (2003) augmente à basse salinité; diminue à une forte salinité Arabidopsis thaliana Fragaria × ananassa cv. Camarosa augmente augmente Quintero et al., (1996) El-Baz et al., (2003) II .5.3.2. Synthèse des enzymes : De nombreux travaux montrent que des enzymes telles que des superoxide dismutases (SOD), des ascorbate peroxydases (APX), des catalases (CAT), des glutathion-S-transférases (GST) et des glutathion peroxydases (GPX) s’accumulent pendant le stress hydrique. La capacité du système antioxydant est déterminante pour maintenir l’intégrité du système photosynthétique lors d’une contrainte hydrique (Reddy et al., 2004). Les travaux menés par Botella et al., (1994), travaillant sur la caractérisation in situ des transcrits de peroxydases chez la tomate en présence d’une faible concentration de Na Cl ( 50 mM), ont montré que cette dose induit l’accumulation des peroxydases. Une étude concernant l’activité de la peroxydase dans le milieu de culture des cellules de tomate, a montré que le milieu dans lequel les cellules sont adaptées à la croissance en présence de 15% de NaCl présente, une activité peroxydase plus élevée que le milieu dans lequel les cellules ne se sont pas adaptées à la croissance en présence de NaCl. Une augmentation de la teneur en protéine a été également observée dans le milieu des cellules 32 Chapitre II/ revu bibliographique le stress chez les plantes adaptées comparé au milieu des cellules non adaptées. Apparemment, les valeurs élevées de l’activité peroxydase dans le milieu des cellules adaptées au sel, reflètent les changements des propriétés mécaniques de la paroi cellulaire, qui à son tour peut être associée au processus d’adaptation (Sancho et al., 1996). Dans le but d’étudier le système de défense antioxydant, les changements induits par le stress salin sur les enzymes antioxydantes sont examinés dans les feuilles de mûrier (Morus sp.) chez une variété tolérante au sel, « Pei ». L’activité de l’enzyme peroxydase guaïacolspécifique augmente remarquablement avec l’augmentation du NaCl à 150 mM. De plus, les activités de la superoxyde dismutase, l’ascorbate peroxydase et la glutathione réductase augmentent légèrement à 150 mM de NaCl. Par contre, l’activité catalase n’est pas corrélée avec le contenu du peroxyde d’hydrogène lors d’une augmentation de sel. Les résultats suggèrent que sous des concentrations élevées de sel, l’activité peroxydase primaire, accentuée, semble jouer un rôle actif dans le nettoyage des types d’oxygène réactif chez cette variété (Harinasut et al., 2003). Un autre facteur du stress, les basses températures font que certaines enzymes sont spécifiquement inactivées par le froid. C’est le cas des enzymes multimériques, pour lesquelles les interactions hydrophobes entre monomères sont affaiblies aux basses températures (Mazliak, 1981). L’effet de la température peut aussi induire des changements réversibles dans la conformation de l’enzyme sans entraîner la dissociation de la protéine en sous unités, comme dans le cas de la RuBP carboxylase. La stabilité de cette enzyme à basse température semble d’ailleurs déterminée par les liaisons –S-S-. En effet, la RuBP carboxylase isolée des plantes endurcies au froid, présente généralement une grande quantité de groupe –SH exposés à la surface de la molécule, et ses propriétés cinétiques suggèrent une meilleure adaptation au fonctionnement à des températures inférieures à I0°C (Challet et al., 1977). 33 Chapitre II/ revu bibliographique le stress chez les plantes 34 Chapitre III : revue bibliographique marqueurs isoenzymatiques Chapitre III : Les marqueurs isoenzymatiques III. 1. Définition : Le terme marqueur génétique est un synonyme de locus marqueur. Un locus marqueur est un locus polymorphe qui renseigne : -sur le génotype de l’individu qui le porte ; c’est à ce titre que les marqueurs sont utilisés en génétique des populations. -sur le génotype d’un (de) locus voisin(s) ; les applications vont ici du clonage positionnel à la sélection assistée par des marqueurs Les plus courants de ces marqueurs génétiques sont, selon une terminologie consacrée, les marqueurs morphologiques, les marqueurs moléculaires (au niveau de l’ADN), et les marqueurs biochimiques (isozyme, protéine). Avec les marqueurs biochimiques, il est aujourd‘hui possible de cartographier conjointement dans une même descendance de très nombreux locus, jusqu'à en «saturer» le génome, c’est-à-dire jusqu’ à ce que tout point du génome soit génétiquement lié à au moins un marqueur. Dans de telles cartes, il y a donc autant de groupes de liaisons que de chromosomes. En sélection classique, chaque lignée est examinée à travers son aspect phénotypique, soit la résultante de l’expression de ses gènes dans un milieu donné. Ces observations se faisant dans des conditions d’interaction entre le génotype et le milieu, il est important pour le sélectionneur de connaître l’aspect purement génétique du caractère étudié, indépendamment de son expression. A cet effet, de nombreux marqueurs biochimiques ou moléculaires ont été développés pour le blé depuis une vingtaine d’années. Cependant, un saut technologique est nécessaire pour valoriser les acquis sur les connaissances individuelles des gènes lors de leur intégration dans les schémas de sélection (Moulai et al., 2009). 36 Chapitre III : revue bibliographique marqueurs isoenzymatiques Pare ailleurs, la sélection assistée par marqueurs est d’une part utilisée pour repérer les caractères ergonomiquement intéressants comme le rendement ou la résistance aux contraintes environnementales. Actuellement, les marqueurs les plus utilises sont les microsatellites (répétition de courtes séquences d'ADN mises en évidence par PCR). L'utilisation des marqueurs moléculaires, aujourd'hui largement répandue, intervient dans divers programmes axes sur l'amélioration de la résistance aux stress biotiques et abiotiques. Et d’autre part, cette sélection correspond à toute forme possible d’utilisation des marqueurs dans le processus d’amélioration. Les principales applications pour le sélectionneur sont : l’identification du matériel, la gestion des ressources génétiques, la conduite des rétrocroisements, la construction de génotypes, la prédiction de l’hétérosis, la prédiction des valeurs génotypiques et la conduite de la sélection récurrente. L’intérêt des marqueurs pour l’identification du matériel est évident (Galias, 1994). L’analyse des systèmes enzymatiques par l’électrophorèse qui fournit des marqueurs iso enzymatiques, reste toujours fiable pour la sélection. Cette méthode est une technique permettant de mesurer la vitesse et le sens de déplacement des molécules organiques en réponse à un champ électrique. La vitesse et la direction du déplacement des protéines sur un gel d’amidon ou d’agar ou d’acrylamide dépendront de la charge superficielle nette de la protéine, de sa taille et de sa forme. L’électrophorèse est particulièrement utile pour l’étude des populations d’une même espèce ou d’espèces étroitement apparentées, et les caractères taxonomiques qui en résultent (répartition des bandes) sont généralement soumis à une analyse phénétique ( Grawford and julian 1967. ; Grawford 1979 – 1983). La sélection et les programmes d’amélioration sont basés sur la recherche des marqueurs génétiques. L’électrophorèse des isoenzymes est un outil pour ce but. Les ressources génétiques estimées par les techniques moléculaires doivent êtres considérées dans les stratégies de protection des plantes. (Hannachi et al., 1998). 37 Chapitre III : revue bibliographique marqueurs isoenzymatiques III. 2. Les isoenzymes : Dès 1950 le problème des isoenzymes a été appréhendé au cours de l’étude de la lactase déshydrogénase partiellement purifiée révèlent la présence de 5 constituants différents possédant cette activité enzymatique. Il s’agit de protéines très voisines par leurs propriétés et qui ne sont séparées que grâce au pouvoir de résolution élevé des méthodes électrophorétiques. L’explication a été fournie par un nouvel examen de ces 5 protéines à l’état dénaturé. Par électrophorèse du mélange des 5 enzymes en présence d’urée (maintenant avec le SDS) on ne trouve plus que 2 constituants. Les différentes isœnzymes semblent donc différer les unes des autres par des propriétés de détail, notamment par leurs paramètres cinétiques et leurs spécificités. La synthèse des différentes sous-unités d’un tissu à l’autre résulte d’adaptations physiologiques. L’enzyme est apparemment optimisée dans chaque cas pour répondre aux exigences. Les isoenzymes s’observent sous forme de bandes multiples après une séparation qui est le plus souvent une électrophorèse. (Jean, 1993). L’analyse par isozyme est relativement aisée, bon marché, rapide et ne nécessite pas un équipement de laboratoire sophistiqué mais l’inconvénient majeur consiste dans le nombre réduit de variante électrophorétiques (Oléo et al., 1993). C’est chez le maïs (Zea mayas .L) peut être plus que chez aucune autre plante, qu’il y eut des études sur les isoenzymes. Elles sont passées des études purement biochimiques, étude des propriétés enzymatiques, aux études de sélection concernant le contrôle et le maintien de la qualité durant la production de graines. De plus, la plupart des gènes de structure codant pour les isoenzymes du maïs étudiées, ont été localisés sur des sites chromosomiques spécifiques ( Godman et Stuber, 1983 cité par Fyad Lameche , 1999). Les marqueurs isoenzymatiques sont largement utilisés dans la recherche biologique, ne causent aucun changement délétère dans le phénotype par récessivité ou pléiotropie et 38 Chapitre III : revue bibliographique marqueurs isoenzymatiques s’expriment généralement de façon codominante relativement simple en stocks de plusieurs marqueurs (Tansley et Rick, 1980). Puisque l'activité catalytique des enzymes peut être l’action de plusieurs protéines, le terme "isoenzymes" a été adopté pour les distinguer par les différences dans leur activité (Subden et al., 1987). III.2.1 Les estérases: Les estérases mises en évidence par cette réaction de révélation catalysent la réaction suivante : Aryl-acetate + H2o Aryl alcool+acetate Les estérases cathodiques et les estérases anodiques constituent deux grands groupes. Ce sont des enzymes très variables en fonction des espèces et des populations, et beaucoup plus en fonction des stades de développement (FYAD-LAMECHE.F.Z., 1999). En effet, il existe chez le Maïs des estérases que l’on trouve à tous les stades de développement et d’autres qui sont spécifiques de certains stades de développement. Le nombre d’allèles identifiés à chaque locus estérase varie de 2 à 9. (Godman et Stuber, 1983) cité par (Fyad-Lameche.., 1999). L’activité des estérases qui est liée au stade physiologique et métabolique de la cellule, peut être affectée par les facteurs environnementaux tels que la température de culture, le stress hydrique et les agents polluants. (Bilkova et al, 1999). Les estérases ont été les premiers isozymes dont le déterminisme génétique a été analysé (Desborough et Peloquin ,1967). D’autre systèmes se sont peu à peu développés aussi bien en utilisant les gels de polyacrylamide que les gels d’amidon (Staub et Kuhns, 1979 ; Desborough, 1983). A ce jour, environ une cinquantaine de systèmes sont connus de façon plus ou moins précise au niveau de la technique de séparation ou de leur déterminisme génétique. 39 Chapitre III : revue bibliographique marqueurs isoenzymatiques L’analyse de différents profils d’estérases chez l’espèce Hydysarum coronarium (légumineuse) permet de révéler l’existence de 13 bandes isoenzymatique (Trifi N et al.,1989). Reyes et al., ( 1998) avaient détecté un total de 14 bandes réparties en 5 zones d’activité enzymatique en analysant les feuilles de 15 clones de l’écotype Musa( variété de bananier) provenant de culture «in vitro», ce qui indiquerait que ces bandes pourraient être activées au cours d’autres phases de développement de plante. III.2.2. Les peroxydases : III.2.2.1. Définition : Les peroxydases des plantes, appelées aussi peroxydases de classe III, catalysent l’oxydation de plusieurs substrats dont les phénols en présence du peroxyde d’hydrogène (H2O2). (Baaziz, 2006). Elles jouent des rôles importants dans la croissance, le développement et le système de défense des plantes contre les stress biotique et abiotique (Gaspar et al., 1985). Elles sont codées par des familles multigéniques, regroupant par exemple 73 gènes chez Arabidipsis thaliana ou 138 chez le riz (Oryza sativa japonica). Il a été montré que la plupart des gênes sont exprimés chez Arabidopsis, certains constitutivement, d’autres en réponse à divers stimuli. Bien que leur fonction soient connues en général, il est très difficile d’assigner un rôle précis a chaque isoforme (Penel et al., 2004). Les peroxydases sont comme la catalase des protéines héméniques à haut spin. Elles sont particulièrement répandues chez les plantes. Il est très facile de mettre en évidence celle du radis qui broyé dans un peu d’eau oxygénée diluée, constitue un mélange pouvant changer rapidement la couleur des produits organiques variés par exemple la benzidine ou le gaïacol. Les peroxydases sont en général peu spécifiques des produits oxydés, leur fonctionnement rappelle celui de la catalase en passant par un composé I, obtenu après perte de 2 électrons. (Jean, 1993). 40 Chapitre III : revue bibliographique marqueurs isoenzymatiques Ces oxydoréductases très répandues chez les plantes, sont souvent utilisées comme marqueurs de la tolérance à de nombreux stress biotiques et abiotiques. (Aouad et al., 1997). II.2.2.2. Historique : En 1810, Planche décrit l’apparition d’une couleur bleue, sur des morceaux de racine de raifort incubé dans de la teinture de gaïac. En 1818, Thenard fut le premier à décrire les propriétés d’eau oxygénée (H2O2) et Schönbein, en 1855, décrit l’oxydation de certains composés organiques, catalysée par des extraits issus de plantes ou d’animaux, en présence de solutions diluées de peroxyde d’hydrogène (H2O2). Le nom de peroxydase fut donné en 1898 par Linossier, a un extrait de pus humain présentant une telle activité (Saunder et al., 1964). Les fameuses peroxydases de raifort furent l’outil de base des premiers travaux moléculaires sur les peroxydases végétales (Theorell, 1942) et c’est en 1976, grâce aux travaux de Braithwaite, d’une part et de Welinder, d’autre part, qu’on a pu avoir une première image cristalline d’une de ces enzymes, ainsi que la première séquence protéique. Il a fallu attendre ensuite plus de 10 années pour voir publier la première séquences nucléotidique d’un messager codant pour une peroxydase du tabac (Lagrimini et al., 1987). C’est principalement sur la base de ces travaux, qu’aujourd’hui les données moléculaires concernant les peroxydases végétales ont pu s’accumuler de manière plus que significative. III.2.2.3. Structure chimique des peroxydases : Les peroxydases sont des enzymes à hèmes constituant une très grande famille multigénique, dans laquelle on distingue trois classes différentes (Passardi et al., 2005) : la classe I strictement intracellulaire (EC 1.11.1.5.6/.11), la classe II excrétée par les champignons (EC 1.11.1.13/.14), et la classe III constituée par les peroxydases végétales (EC 1.11.1.7). Les peroxydases sont de petites glycoprotéines (40.000 à 50.000 daltons) combinées avec une ferriporphyrine (figure. 5). 41 Chapitre III : revue bibliographique Protoporpherine marqueurs isoenzymatiques Fe3+ Apoprotéine Protohaematine IX Glycosylation (RE) Glycoprotéine Peroxydase Figure. 6 : Représentation schématique de la constitution des peroxydases végétales (Thierry, 2002). III.2.2.4. Localisation et mobilité des peroxydases : Le nombre croissant de peroxydases connues, ainsi que les investigations de plus en plus poussées concernant leurs rôles physiologiques chez les plantes, obligent à déterminer de manière plus précise leur localisation subcellulaire. Globalement, les peroxydases peuvent se trouver au niveau des parois cellulaires et dans les vacuoles. Les peroxydases pariétales sont connues pour être impliquées dans les processus de lignification (Thierry, 2002). III.2.2.5. Rôle physiologique : Le nombre possible de substrats pour les peroxydases est énorme, et il peut être admis que chaque réaction peroxydasique ayant lieu joue un rôle spécifique dans le maintien ou l’adaptation des structures et des fonctions des cellules végétales dans leur environnement. Les interactions des peroxydases dans les processus de croissance, de différenciation et de développement, sont plutôt limitées et concernent plusieurs opérations, à savoir la régulation de la teneur en auxine, le contrôle possible de la dernière étape de la biosynthèse de 42 Chapitre III : revue bibliographique marqueurs isoenzymatiques l’éthylène, la participation dans l’établissement du potentiel redox de la membrane plasmique, la formation de la H2O2 et la construction, la rigidification et éventuellement la lignification et la subérisation des parois cellulaires. Ce rôle intervient à partir de la régulation du taux circulant de l’acide indole-3-acétique (AIA) par le biais de son catabolisme oxydatif ; mais les peroxydases interviennent aussi dans la perte de la plasticité des parois cellulaires, en formant des ponts phénoliques entre les polymères de la paroi (Biggs, 1987). Ce dernier processus conduit à une rigidification irréversible de la paroi qui empêche une expansion cellulaire par l’augmentation de la pression de turgescence. Ainsi les peroxydases réguleraient le taux endogène d’un des principaux facteurs de croissance, l’AIA, et les derniers stades de la croissance cellulaire. Les peroxydases ont longtemps été considérées comme des enzymes impliquées dans des réactions réduisant la croissance des cellules végétales, grâce à la destruction de l’auxine et la formation de liaisons covalentes au sein des parois (Penel et al., 1992). Depuis les travaux pionnier de Ven overkeek dans les années 30 sur le nanisme végétal, un grand nombre d’études ont été réalisées dans le but de mettre en relation les travaux endogènes de l’activité peroxydasique avec la croissance cellulaire (Gasper et al., 1982). Le nanisme végétale, est généralement associé a une augmentation de l’activité peroxydasique dans la fraction pariétale (Evans 1990, Jupe et Scott 1989). La croissance normale chez des plantes naines peut être restaurée par des applications exogènes de gibbérelline : la restauration de la croissance est concomitante avec une inhibition de la sécrétion des peroxydases ( Fry, 1980). Des résultats similaires proviennent d’applications exogènes d’AIA sur des tissus végétaux. Ainsi la stimulation de la croissance par l’AIA est associée sur une courte période à une rapide diminution du niveau des peroxydases extracellulaires (Jones, 1986 Ros Barcelo et al., 1989) bien que par la suite on observe une stimulation de la sécrétion Ca 2+ dépendante des peroxydases (Gaspar et al., 1983). 43 Chapitre III : revue bibliographique marqueurs isoenzymatiques Pour l’instant, aucun résultat ne permet de dire clairement si les peroxydases sont à l’origine ou la conséquence des processus biochimiques qui conduisent à l’arrêt de la croissance. Dans le premier cas, les peroxydases auraient une influence sur le potentiel de croissance des cellules, dans le deuxième cas, elles interviendraient dans la perte irréversible de ce potentiel (Thierry, 2002). 44 Expérimentation Matériel et méthodes Chapitre IV : Matériel et méthodes IV.1. Matériel végétal : Le choix des variétés modèles pour l’étude d’expression des PERs et ESTs a été guidé par une caractérisation physiologique de la tolérance et la sensibilité à la salinité de quatre écotypes de Medicago déjà réalisé en laboratoire. Le matériel végétal utilisé dans ce travail comprend deux écotypes tolérants et deux sensibles appartenant à des espèces annuelles de Medicago Ainsi que des medics sauvages récoltés sur le campus de l’EGMO (tableau 2). Espèces écotypes Comportement physiologique M.aculeata Acu 80 sensible Acu 209 tolérant Tru 40 sensible Tru 32 tolérant Ecotype sauvage inconnu ( ?) M.truncatula Medics Tableau 2 : Les différents écotypes étudiés avec leur comportement aux stress salins (Source ITGC., Fyad F.Z., 1999 ; Yahia N., 1998 ; Amouri A., 2005). IV. 2. Protocole expérimental Les essais ont été conduits en laboratoire sur une durée de 9 jours. Pour chaque écotype, les grains ont été désinfectés pendant quelques minutes dans une solution de CaCl2 (hypochlorite de calcium) 6%, puis rincés à l’eau distillée et enfin scarifier. Durant les 6 premiers jours les grains ont été placés à raison de 30 grains dans des boites de Pétri sur du papier filtre imbibé avec, soit de l’eau distillée (témoin T0), soit des solutions salines contenant respectivement 86.6mMol/l (T1), 102.9mMol/l (T2) et 137.2 mMol/l (T3) de 46 Expérimentation Matériel et méthodes chlorure de sodium ( NaCl). Dans les trois jours de germination restants, les jeunes plantules ont été transférées dans la chambre de culture dans d’autres boites de Pétri arrosées avec une solution nutritive Knop en plus des quatre concentrations de NaCl, sous une intensité d’éclairage de 6762 lx et une photopériode de 8 heures. Ces traitements peuvent être résumés comme suit : Les Concentrations des 6 premiers jours Les Concentrations des 3 derniers jours T0 : 100 ml eau distillée + 0g de NaCl T0 : 100 ml du Knop + 0g de NaCl T1 : 100 ml eau distillée+ 86.6mMol/l de NaCl T1 : 100 ml du Knop + 86.6mMol/l de NaCl T2 : 100 ml eau distillée+102.9mMol/l de NaCl T2 : 100 ml du Knop + 102.9mMol/l de NaCl T3 : 100 ml eau distillée + 137.2 mMol/l de NaCl T3 : 100 ml du Knop + 137.2 mMol/l de NaCl IV.3. Séparation des isoenzymes (estérases et peroxydases) par électrophorèses de gel de polyacrylamide (PAGE) : Pour mettre en évidence d’éventuelles modifications biochimiques induites par le stress salin Une analyse qualitative des isoenzymes a été réalisée par PAGE. Le principe de cette méthode d’analyse, consiste à séparer les deux isoenzymes selon leur charges ionique et à comparer les profils électrophorétiques des individus traités par le stress salin (T1, T2 et T3) avec les témoins (T0). IV. 3. 1. Extraction des estérases et peroxydase : L’extraction des ( ESTs) et ( PERs) est menée à froid dans un mortier à partir des jeunes plantes issues de la germination pendant 09 jours pour les lots traités ( T1 , T2 , T3 ) , et le 1er , 3eme , 5eme , 7eme , et le 9eme jour pour les lots témoins (To), afin de prélever 04 plantules ( 0.20 g ) pour chaque extraction . Les jeunes plantules sont broyées dans un tampon 47 Expérimentation Matériel et méthodes d’extraction tris –KCL 1mM (pH = 7), Puis elles sont centrifugées pendant 30 minutes à 13 000 tr/min (a+4°C) ; le surnagent est récupéré et conservé dans un cryoconservateur contenant de l’azote liquide pour être soumis ensuite à l’électrophorèse, pour ce faire, huit extraits sont alors déposés par plaque et la quantité d’extrait enzymatique déposée par puits de trente microlitre ( 30 Ml). Pour les Medics sauvages l’extraction des peroxydases se fait quotidiennement pour les lots témoins et chaque lot traité durant neuf jours. IV. 3. 2. Préparation du gel des estérases et peroxydases: Pour les estérases le support électrophorétiques est constitué d’un gel discontinu (4% à 8%) de polyacrylamide et pour les peroxydases d’un gel gradient contenant (4% à 10%) de polyacrylamide dans un tampon tris-borate EDTA à pH= 8.3 avec du NP10, du TEMED et persulfate d’ammonium. IV. 3. 3. Condition de migration des estérases et des peroxydases : Le tampon cuve pour les estérases est le même que celui utilisé dans la préparation du gel à savoir tris-Borate EDTA pH= 8.3 dilué 10 fois ; mais pour les peroxydases, le tampon cuve est le tris-glycine 0.0685 M (ph 8.6) dilué 10 fois. La migration se déroule à 4°C pendant 7 h sous une intensité de 25 mA la première heure et 30 mA pour le reste du temps et sous une tension permanente de 150 V. IV. 3. 4. Révélation des estérases : Après démoulage du gel, la révélation des activités estérases est effectuée dans un tampon phosphate de sodium (NaH2 PO4) 0,1 M, pH = 6,2, additionné du substrat (α- Naphtylacetate) et du révélateur (Fast Blue RR Salt). Suite à l’apparition des bandes, le gel est fixé dans une solution d’acide acétique à 7%. IV. 3. 5. Révélation des peroxydases : 48 Expérimentation Matériel et méthodes La révélation des peroxydases est réalisée à l’aide d’une solution de substrat de l’odianozidine préparée dans le tampon acétate de sodium 0.2M (pH- 4.6). Pour déclencher la réaction 0.2 ml de H2O2 à 30% est ajoutée, dans l’obscurité et à 25°C; suite à l’apparition des bandes, le gel est fixé dans une solution d’acide acétique à 7%. 49 Expérimentation résultats et interprétation Chapitre V : Résultats et interprétation Afin d’évaluer la tolérance et la sensibilité à la salinité d’une population de genre Medicago, une analyse par électrophorèse d’isoenzymes est entreprise. Cette étude permettrait de mettre en évidence un marqueur génétique utile dans l’évaluation des ressources génétiques et l’amélioration des plantes vis-à-vis de stress. En effet, la réponse des plantes aux stress environnementaux est souvent liée à des changements biochimiques. Les travaux de Fyad Lamech et al., 2008, sur la tolérance et la sensibilité au stress salin, chez certains écotypes de Medicago, ont montré que les écotypes Tru 32 et Acu 209 sont les plus tolérants par contre Tru 40 et Acu 80 sont les plus sensibles. Sur cette base, ces quatre écotypes ont été retenus pour l’analyse de deux systèmes enzymatiques dont le premier est une hydrolase (estérase) et le deuxième une oxydoréductase (peroxydase). Les changements des systèmes enzymatiques chez les écotypes tolérants et sensibles ont été évalués par la présence ou l’absence de bande identifiée par leur Rf. Chaque écotype possède son propre profil et des bandes qui lui sont spécifiques. V.1. Résultats relatifs aux estérases Les profils d’estérases sont suivis durant 9 jours de germination chez les quatre écotypes traités ainsi que leurs témoins. De nombreuses bandes apparaissent avec une mobilité différente d'un écotype à l’autre. L’analyse des différents profils, au niveau des différents écotypes, a permis de révéler l’existence d’une variabilité isoenzymatique intrapopulation et interpopulation. Au niveau de l’espèce Truncatula, les résultats montrent chez l’écotype tolérant Tru 32, 11 bandes isoenzymatiques, réparties en 3 zones, une zone à migration lente (ZI), une autre à migration rapide (ZIII), et enfin, une intermédiaire (ZII). Alors que, chez l’écotype sensible 51 Expérimentation résultats et interprétation Tru 40, seulement 9 bandes sont affichées, représentant chacune une estérase, réparties en 2 zones. (Figures. 6a et 6b). Par contre au niveau de l’espèce Aculeata, les écotypes tolérants Acu 209 et Acu 80 sensible leurs profils exhibent 5 à 6 bandes d’estérases réparties en 2 zones. (Figures 8 et 9). D’autre part, les résultats montrent que l’expression des estérases en ce qui concerne le témoin, est de deux types : un type constitutif qui se révèle dans tous les stades de développement chez les individus traités ou témoins, et un type spécifique à chaque stade de croissance. Cette expression différentielle diffère d’un écotype à un autre que ce soit chez les écotypes tolérants ou sensibles. Au niveau de l’écotype tolérant (Tru 32), au premier jour de croissance le profil des estérases exhibe quatre bandes (Est-3, Est-7, Est-8 et Est-9) avec des Rf compris entre 0.34, et 0.78, alors que, pour le troisième jour de développement, nous constatons une différence dans l’activité estérasique par rapport au premier jour. En effet, d’après la figure (6 (a) et 7 (a) ) et leur phénotype électrophoretique du Rf, il y apparait cinq bandes Est-1, Est-2, Est-5, Est-6 et Est-10 avec des Rf de 0.12, 0.14, 0.43, 0.50, et 0.81 avec l’absence d’Est-3 et Est-7. Au 5eme jour, on note une diminution progressive de cette activité, de sorte que les bandes estérasiques précédentes disparaissent (Est-8, Est-9, Est-10). Au bout du 7eme jour de croissance le profil présente la révélation de deux nouvelles bandes moins intenses (Est-4 et Est-11) avec des Rf de 0.37 et de 0.89 respectivement. Après neuf jours de croissance, on observe une augmentation de l’activité esterasique avec la réapparition de certaines bandes disparues au niveau des stades précédent (Est-3, Est-6, Est-7, Est-8, Est-9, et Est-10). Donc, il semble bien que l’expression de certaines bandes et leurs disparition est en relation avec chaque stade de développement de la plante, alors que d’autres s’expriment tout le temps durant toute la phase de croissance du végétale (figure 6a). 52 Expérimentation résultats et interprétation Quant à l’écotype sensible Tru40, le premier jour de germination présente deux bandes Est-7 et Est-8 avec des Rf de 0.62 et de 0.68. Cette activité augmente avec la croissance de la plante. Dans le troisième jour, on note l’existence de six bandes Est-1, Est-4, Est-5, Est-7, Est-8 et Est-9 avec des Rf compris entre 0.15 et 0.75. Après le cinquième jour cette activité diminue et présente quatre bandes seulement (Est-3, Est-6, Est-7 et Est-8) avec des Rf de 0.35, 0.51, 0.62 et 0.75. La situation au septième jour est identique à celle du premier jour, par contre, au niveau du neuvième jour de croissance l’activité estérasique augmente. En plus des bandes (constitutives) (Est-6, Est-7, Est-8), une estérase spécifique à ce stade est nouvellement exprimées (Est-2) ( Figure 6 (b) et 7 ( b) ). Lorsque la plante est soumise au stress, l’expression des estérases est différente d’un traitement à un autre et d’un écotype à un autre. Pour une concentration de sel de 86.6 mMol/l (T1) le profil de l’écotype Tru32 correspond au profil du cinquième jour du témoin, donc il s’est révélé un ralentissement de 4 jours, alors que, pour les traitements T2 et T3 les profiles ressemblent au profil du neuvième jour (Figure 6 (a) et 7(a)) donc l’activation des estérases ne s’est pas modifiée pour le type tolérant à ce niveau de concentration de sel. En ce qui concerne l’écotype Tru 40, quelque soit la concentration du sel, les profils des estérases sont identiques au profil du 1er jour de croissance du contrôle ; en conséquence il est apparu un ralentissement de 8 jours avec la révélation de la bande Est-9 (bande révélée au 3eme jour seulement) (Figure 6 (b) et 7(b)). 53 Expérimentation 1j 3j 5j résultats et interprétation 7j 9j T1 T2 1j T3 3j 5j 7j 9j T1 Est-1 (0.12) Est-2 (0.14) Est-1( 0.15) Est-2 (0.31) Est-3( 0.34) Est-5(0.43) Est-3 (0.35) Est-4 (0.37) Est-4( 0.41) Est-6 (0.50) Est-5 (0.48) Est-6 (0.51) Est-7 (0.56) Est-8 (0.67) Est-7 (0.62) Est-9 (0.78) Est-8 (0.68) Est-9 (0.75) Est-10(0.81) Est-11 (0.89) a) b) Figure 6: zymogramme et Rfs des différentes Estérases, chez l’écotype Tru 32 (a) et Tru 40 ( b) , pour le lot témoin (différents stades de croissance : 1jour, 3jours, 5jours, 7jours, et 9 jours) et les lot traités ( T1, T2, T3) ZI ZI ZII ZII ZIII 1j 3j 5j 7j 9j T1 T2 T3 + a) b) Figure 7: phénotypes électrophoretiques du Rfs des différentes Estérases, chez l’écotype Tru 32 et Tru 40 ( b) , pour le lot témoin (différents stades de croissance : 1jour, 3jours, 5jours, 7jours, et 9 jours) et le lot traité ( T1, T2, T3). 54 T2 T3 Expérimentation résultats et interprétation En ce qui concerne l’espèce Aculeata, les résultats montrent aussi une certaine variabilité dans l’expression des estérases chez le témoin, ceci pour les différents stades de développement de la plante, et chez les plantes traitées à différentes concentration de sel. Cette variabilité enzymatique diffère aussi chez les deux écotypes de cette espèce. Pour l’écotype Acu 209, cinq bandes Est-1, Est-2, Est-3, Est-4 et Est-5 avec des Rf de 0.12, 0.18, 0.25, 0.32 et de 0.50, sont observées dans la zone I (figure 8 (a) et 9 (a) ), correspondant à une vitesse de migration lente chez la variété tolérante . Le profil du 1er jour présente trois bandes d’activité Est-3, Est-4 et Est-5 avec des Rf de 0.25, 0.32 et de 0.50. Cette activité augmente dans le deuxième profil qui correspond aux plantules âgées de trois jours par la révélation d’Est-2 avec un Rf de 0.18. Le 5eme et le 9eme jour expose les mêmes bandes avec la révélation d’une nouvelle bande nommée Est-1et la disparition d’Est-2 et Est-3, tandis que le 7eme jour de germination montre deux bandes seulement Est-4 et Est-5 qui sont révélées régulièrement durant tous les jours de germination, avec une nette intensité (figure 8 (a) et 9 (a) ). Sous les conditions stressées, le lot (T1) correspondant à la concentration 86.6mMol/l présente deux zones d’activité des estérases Est-5 et Est-6 et ce lot est semblable au 7eme jour du lot témoin, par conséquent, il est apparu un ralentissement de deux jours, par contre pour (T2) et (T3) les lots sont identiques à ceux du 1er jour et donc le stress à provoqué un ralentissement de 9 jours (figure 8 (a) et 9 (a) ). Le profil des estérases chez l’écotype sensible Acu 80 présente un nombre plus élevé de bandes que chez l’écotype tolérant Acu 209. En effet, 6 bandes estérasiques ont été révélées. Le premier jour, ce dernier exhibe trois bandes Est-3, Est-4 et Est-6 avec des Rf 0.28, 0.34 et 0.56. Les deux bandes Est-4 et Est-6 persistent jusqu’au 5eme jour de germination, le troisième jour est caractérisé par les deux bandes précédentes avec la révélation d’une nouvelle bande (Est-2) de Rf 0.20. Pour le cinquième jour, on note la disparition d’Est-2 et Est-3 et la 55 Expérimentation résultats et interprétation révélation d’Est-1 avec un de Rf 0.15. Les lots du 7eme et du 9eme jour présentent le même nombre de bandes Est-5 avec un Rf de 0.40 nouvellement synthétisé et Est-6. Dans les profils des plantules traitées par T1, T2 et T3, l’intensité des bandes est très forte, le même nombre de bandes est présent dans le profil du lot témoins âgé de 1 J de germination et par conséquent le sel a provoqué un retard de 9 jours (figure 8 (a) et 9 (a) ). 56 Expérimentation 1j 3j 5j résultats et interprétation 7j 9j T1 T2 T3 1j Est-1 (0.12) Est-1( 0.15) Est-2 (0.18) Est-2 (0.20) Est-3 (0.25) Est-3 (0.28) 3j 5j 7j 9j T1 T2 Est-4( 0.34) Est-4 (0.32) Est-5 (0.40) Est-5 (0.50) Est-6 (0.56) a) b) Figure 8: zymogramme et Rfs des différentes Estérases, chez l’écotype Acu 209 (a) et Acu 80 ( b) , pour le lot témoin (différents stades de croissance : 1jour, 3jours, 5jours, 7jours, et 9 jours) et les lot traités ( T1, T2, T3). - ZI ZI ZII ZII 1j 3j 5j 7j 9j 1j 3j 5j 7j T1 T2 T3 9j T1 T2 T3 + a) b) Figure 9: phénotypes électrophoretiques du Rfs des différentes Estérases, chez l’écotype Acu 209 (a) et Acu 80 (b), pour le lot témoin (différents stades de croissance : 1jour, 3jours, 5jours, 7jours, et 9 jours) et les lots traités (T1, T2, 57 T3 Expérimentation résultats et interprétation V.2. Résultats relatifs aux peroxydases (PER). V.2.1. Changements des profils des peroxydases chez les deux espèces Truncatula, Aculeata et une population sauvage (inconnue). Les profils des peroxydases sont aussi suivis durant 9 jours de germination chez les quatre variétés traitées et leurs témoins par des extractions alternées. Par contre chez le Medic sauvage des extractions journalières sont effectuées pour tous les lots T0, T1, T2, T3. L’analyse des différents profils des peroxydases permet de révéler l’existence de 15 bandes d’activité enzymatique. En absence de stress, cette activité des peroxydases diffère dans le temps, c’est-à-dire chaque stade de développement de la plante présente des bandes spécifiques. Certaines bandes apparaissent pendant les premiers jours de croissance pour disparaître les jours suivants. Chez l’espèce Truncatula, en absence de stress, l’écotype tolérant Tru 32, montre une bande enzymatique (PER-3 de Rf 0.20) au niveau du 1er et du 5eme jour, puis celle-ci disparait au niveau des autres jours. En outre la PER-1 (Rf 0.08) révélée le 2eme jour persiste jusqu’au 9eme jour de germination. Au niveau du 7eme et 9eme jour, le même nombre de bandes ont été observées PER-1 et PER-2 avec un Rf de 0.08 et 0.10 (Figure 10 (a), 11 (a) ). Chez l’écotype sensible Tru 40, cinq bandes peroxydasiques ont été observées. Le lot du 1er jour de germination exhibe une seule bande PER-3 avec un Rf de 0.26. Le 3eme, le 5eme et le 7eme jour révèle une seule bande aussi PER-1 ( Rf 0.08) migrant dans la zone (I). Ont trouve toujours une disparition des bandes et une révélation des autres. En effet le lot du 9eme jour a exhibé une nouvelle bande PER-2 avec un Rf de 0.15 et la disparition des bandes précédentes. En conditions de stress pour une concentration de 86.6Mm/l (T1), l’effet du sel active la synthèse des nouvelles bandes d’intensité moyenne migrant avec un Rf de 0.32 (PER-3) chez l’écotype tolérant Tru 32, alors que chez l’écotype sensible Tru 40 elle est de Rf de 0.39 58 Expérimentation résultats et interprétation (PER-5). Pour des concentrations de 102.9mMol/l (T2) et 137.2 mMol/l (T3), le sel entraîne une inhibition de synthèse de cette bande chez l’écotype tolérant, par contre l’écotype sensible présente toujours cette bande pour qu’elle disparaisse sous le traitement (T3) avec la révélation ou la synthèse d’une nouvelle bande PER-3 avec un Rf de 0.19. (Figure 10 (a), 11 (a) et 10 (b), 11 (b)). 59 Expérimentation 1j 3j 5j 7j résultats et interprétation 9j T1 T2 1j T3 PER-1 (0.08) 3j 5j 7j 9j T1 T2 PER -1 (0.08) PER -2(0.10) PER -2 (0.15) PER -3 (0.19) PER -3 (0.22) PER -4(0.26) PER -4 (0.32) PER -5(0.39) a) b) Figure 10: Zymogramme et Rfs des différentes Peroxydases, chez l’écotype Tru 32 (a) et Tru 40 ( b) , pour le lot témoin (différents stades de croissance : 1jour, 3jours, 5jours, 7jours, et 9 jours) et les lot traités (T1, T2, T3). - ZI ZI ZII ZII 1j 3j 5j 7j 9j T1 T2 T3 1j 3j 5j 7j 9j T1 T2 T3 + a) b) Figure 11: phénotypes électrophorétiques du Rfs des différentes Estérases, chez l’écotype Tru 32 (a) et Tru 40 (b), pour le lot témoin (différents stades de croissance : 1jour, 3jours, 5jours, 7jours, et 9 jours) et les lots traités (T1, T2, T3). : Flèche indiquant une isoenzyme de stress (PER-4 et PER-3). 60 T3 Expérimentation résultats et interprétation Chez l’espèce Aculeata, en absence de stress, l’écotype tolérant Acu 209 montre différente formes peroxydasiques, au niveau des plantules issues de post-germination pour les différents jours (1er, 3eme, 5eme ,7eme et 9eme). Après une croissance de 1 jour, nous notons seulement la présence d’une seule bande PER-3 (Rf 0.32). Après 3 jours de croissance, une bande (PER-1 avec un Rf de 0.07) est nouvellement synthétisée en plus de celle du premier jour. Le profil reste inchangé le 5eme jour. Au bout de 7 jours de croissance, le profil révèle une bande (PER2 avec un Rf de 0.12 et la disparition des deux autres bandes. Enfin, après neuf jours de croissance, une bande nouvellement synthétisée PER-4 (0.39) est révélée. En conclusion, l’activité peroxydasique, en condition naturelle, semble évoluer quantitativement avec le stade de croissance de la plante (figure 12 (a) et 13 (a)). Quant à l’écotype sensible Acu 80 (figure 12 (b), 13 (b) ) il’ a révélé aussi une seule bande de Rf 0.30 après 24heurs de germination. Au bout de 3 jours de germination, nous constatons la synthèse de deux bandes de peroxydase PER-1 et PER-4 avec des Rf de 0.10 et de 0.30 respectivement, le 7eme jour présente une faible activité, et enfin, les lots du 9eme et du 5eme jour ont exhibé une nouvelle bande PER-2 avec un Rf de 0.12. La séparation èlèctrophorétique des peroxydases des jeunes plantules cultivées en présence de NaCl (86.6mMol/l (T1), 102.9mMol/l (T2) et 137.2 mMol/l (T3)), a permis de révéler des changements dans la synthèse des peroxydases. En effet, après 9 jours de stress salin, le lot traité T1, révèle une seule bande (PER-3) d’activité peroxydasique chez l’écotype tolérant Acu 209 et cinq bandes chez l’écotype sensible Acu 80 (PER-2, PER-3, PER-4, PER-5 et PER-6). Chez ce dernier, l’activité des PERs semble diminuer en fonction de la concentration du stress. De plus, les profils sont semblables au profil du 3eme jour du témoin. Il est probable que le stress entraine un retard d’activité de 6 jours (figure 12 (b) et 13 (b)). Pour l’écotype Acu 209, l’intensité des deux bandes (PER-2 et PER-3) augmente avec 61 Expérimentation résultats et interprétation l’intensité du stress. Les profils de T2 et de T3 correspondent au 5éme jour témoin et par conséquent nous remarquons un ralentissement de 4jours. V.2.2. Changements des profils des peroxydases chez la population sauvage de Medicago. D’après la figure (14), le profil de l’activité des peroxydases montre que la distribution des bandes de peroxydases varie en fonction de la croissance. C’est-à-dire que cette activité est beaucoup plus importante pendant les 6eme, 7eme et 8eme jours, par la révélation de 5 bandes. Alors que cette activité est faible durant les premiers jours de croissance ou on peut noter la présence de deux bandes seulement. Le profil du lot témoin pendant les croissances des neuf jours, montre la synthèse de 5 bandes peroxydasiques : deux bandes sont synthétisées pendant les différents stades de croissance (PER-1 et PER-3), alors que les trois autres sont spécifiques à des stades différents (PER-2, PER-4 PER-5). La bande PER-2 est synthétisée seulement au niveau du 7eme, et 8eme jour, et semble être inhibée durant les autres jours de croissance. Les bandes PER-4 et PER-5 quant à elles, elles sont synthétisées à partir du 6 eme jour. En présence du sel, la bande PER-1 est synthétisée avec un retard de 5 jour au niveau du lot traité T1. L’augmentation de la concentration a accéléré l’activation de cette bande ; en effet, elle a été révélée à partir du 2eme jour au niveau du traitement T2 et à partir du 1er jour au niveau du traitement T3 (Figure 14, 15,16 et 17). 62 Expérimentation 1j 3j 5j résultats et interprétation 7j 9j T1 T2 1j T3 PER-1 (0.05) PER-1(0.10) PER-2 (0.12) PER-2(0.12) 3j 5j 7j 9j T1 T2 T3 PER-3 (0.17) PER-4 (0.30) PER-3(0.32) PER-4 (0.39) PER-5(0.40) PER-6 (0.45) a) b) Figure 12: Zymogramme et Rfs des différentes Peroxydases, chez l’écotype Acu 209 (a) et Acu 80 (b), pour le lot témoin (différents stades de croissance : 1jour, 3jours, 5jours, 7jours, et 9 jours) et les lots traités (T1, T2, T3). ZI ZI ZII ZII 1j 3j 5j 7j 9j T1 T2 T3 1j 3j 5j 7j 9j T1 T2 T3 + a) b) Figure 13: phénotypes électrophorétiques du Rfs des différentes Peroxydases, chez l’écotype 209 (a) et Acu 80 (b), pour le lot témoin (différents stades de croissance : 1jour, 3jours, 5jours, 7jours, et 9 jours) et les lots traités (T1, T2, T3). : Flèche indiquant des iso enzymes de stress (PER-3, PER-5, PER-6). 63 Expérimentation 1j 2j 3j résultats et interprétation 4j 5j 6j 7j 8j 9j 1j 2j 3j 4j 5j 6j 7j 8j 9j PER-1 PER-2 PER-3 PER-4 PER-5 PER-6 Fig 14. Profile électrophorétiques des PERs, systèmes PAGE-TBE (gradient 4-10%) d’écotype Sauvage de Medicago. Puits 1 à 9 témoins : 1jr, 2jrs, 3jrs, 4jrs, 5jrs, 6jrs, 7jrs, 8jrs, et 9 jrs de croissance respectivement. 1j 2j 3j 4j 5j 6j 7j 8j Fig 15. Profile électro phorétiques des PERs, système PAGE-TBE (gradient 4-10%) d’écotype Sauvage de Medicago.Puits 1 à 9 traités (T1 86.6mMol/l) : 1jr, 2jrs, 3jrs, 4jrs, 5jrs, 6jrs, 7jrs, 8jrs, et 9 jrs de croissance respectivement. 9j 1j Fig 16. Profile électro phorétique des PERs, système PAGE-TBE (gradient 4-10%) d’écotype Sauvage de Medicaco. Puits 1 à 9 traités, T2 (102.9 mMol/l) : 1jr, 2jrs, 3jrs, 4jrs, 5jrs, 6jrs, 7jrs, 8jrs, et 9 jrs de croissance respectivement. 2j 3j 4j 5j 6j 7j 8j 9j Fig 17. Profile électro phorétique des PERs, système PAGE-TBE (gradient 4-10%) d’écotype Sauvage de Medicago. Puits 1 à 9 traités, T3 (137.2 mMol/l). : 1jr, 2jrs, 3jrs, 4jrs, 5jrs, 6jrs, 7jrs, 8jrs, et 9 jrs de croissance respectivement. Fleche indiquant des bandes peroxydasique. 64 Expérimentation résultats et interprétation VI. Discussion. Les mécanismes de résistance des plantes aux stress abiotiques sont extrêmement compliqués, cette résistance est quantitativement contrôlée par plusieurs gènes codant, par l’activité des iso enzymes. Les études sur les iso enzymes ont été appliquées dans les recherches de génétique et d'écophysiologie. Beaucoup de chercheurs ont conclu que ces iso enzymes jouent un rôle considérable dans la taxinomie, la phylogénétique et la variabilité des populations (Shannon, 1968 ; Gottlieb, 1982 ; Schmitz et al., 1986). Les isoenzymes ont été examinés aussi par rapport au stress environnementaux. Ces chercheurs ont rapporté aussi que les modifications de l’activité des isozymes chez les plantes étaient considérablement liées à la tolérance et à la sensibilité au stress salin. Donc, les isozymes pourraient être considérées ; comme un marqueur biochimique pour la tolérance au stress salin chez les plantes ( Foolad et al., 1993 .; Basu et al., 1997 ) . VI. 1. Modifications des estérases sous un stress salin : L’électrophorèse des isoenzymes représente un bon outil pour établir des marqueurs génétiques utiles dans l’évaluation des ressources génétiques et l’amélioration des plantes. Leurs variabilités intra et inter spécifiques ont été étudiées par plusieurs chercheurs, Bingham et Yeh (1971), chez Medicago sativa, Frankel et Garber (1965), chez Pisum sativa, et Desborough et Peloquin (1968), chez Solanum tuberosum. La plupart des estérases ont, en général, une gamme de substrats, et elle n’ont aucune sans une fonction biologique spécifique connue. Car, depuis longtemps elles ont été utilisés comme des marqueurs enzymatiques d'embryogenèses et organogenèses somatiques (Chibbar et al., 1988, Coppens et al., 1990). Les estérases ont été associées aussi à la résistance, chez l’orge vis-à-vis du mildiou (Hwang et al. 1982), ainsi que dans la symbiose et la fixation de l’azote (Pringle et al., 2004). Ces auteurs montrent que le gène codant pour l’activité des 65 Expérimentation résultats et interprétation 'estérase s’exprimé tôt dans le développement du nodule. Dans la paroi cellulaire la pectinemethylesterases est responsable de la démethylation de la polygalacturonase. Cette réaction affecte le pH d'apoplast et la concentration ionique réglant ainsi plusieurs enzymes hydrolytiques et la rigidité des parois cellulaires (Micheli, 2001). De même, Bordenave et al., 1995, ont rapporté que l'acétyle estérase joue un rôle important dans les modifications de la paroi cellulaire. En outre, leur rapport avec le développement des plantes en fait un marqueur convenable de développement. Plusieurs auteurs utilisent le système des estérases pour l’identification des espèces (Krulíková et al., 2002 ; Tsanev et al., 2004 ; Stoilova et al., 2006). Plusieurs travaux effectués sur différentes espèces ont montré l’existence d’une forte relation entre la réponse enzymatique et le stress salin (waked ferreira, 2002; Amal, 2005) et dans le but de mieux quantifier cette relation, nous avons entrepris l’étude du polymorphisme enzymatique en relation avec le stress salin chez quatre populations de Medicago appartenant à deux espèces différentes (M. truncatula et M. aculeata ). A partir de l’ensemble des données obtenues en analysant les différentes espèces annuelle de Medicago, nous avons pu mettre en évidence une importante variabilité intra et inter population. En effet, pour différentes concentrations de NaCl, la réponse électrophoretique de l’activité des estérases diffère d’une espèce à une autre et à l’intérieur même de la même espèce. Les écotypes des 2 espèces étudiées montrent une richesse allozymique. Les profils électrophorétiques du système estérase chez les écotypes tolérants (Tru 32 et Acu 209), et les écotypes sensibles (Tru 40 et Acu 80), montrent une activité d’expression variable pendant les neuf jours de développement en condition normal et sous stress salin. En effet, ces profils ne se répètent pas de la même façon entre les écotypes. Certaines bandes sont synthétisées pendant les premiers jours de croissance pour qu’elles se voient inhibées lors des 66 Expérimentation résultats et interprétation stades les plus avancés, contrairement à d’autres qui ne sont synthétisées qu’à des stades avancés. Une étude envisagée chez les graines oléagineuses sur l’activité amylasique a permis de penser que durant la phase de repos et dans les premières heures de germination de la plantule, les graines oléagineuses tirent leurs réserves énergétiques de l’action première de cette amylase (Jridi et al., 1999), après l’hydrolyse des lipides par des estérases. (Heller et al., 1993). Cela laisse penser que les mêmes mécanismes peuvent se produire chez les protéagineuses. Ram et al., (1977) ont travaillé sur la germination des graines de Lettuce (Lactuca sativa. L), et ont trouvés que l’activité des estérases est stimulée après 24h de germination et que cette activité augmente jusqu'à 3 fois au bout de 48h de germination. Chez le Maïs, Godman et al., (1983) cité par ( Fyad-Lameche, 1999) ont démontré qu’ il existe des estérases présentes à tous les stades de développement et d’autres qui sont spécifiques de certains stades de développement . Yurenkova et al., (1995) montrent bien que l’activité des estérases est en fonction du stade de développement de la plante. Ces auteurs montrent que les premières heures de germination sont accompagnées par la formation de nouvelles estérases qui étaient inhibée pendant la phase dormante de la graine. Ils en concluent que la transition entre la phase d’imbibition de la graine et la phase post-germinative est suivie par un rapide réarrangement du système enzymatique. Au bout de 24h seulement de germination, de nouvelles estérases sont formées au niveau plantule, et celles qui étaient synthétisées pendant la phase d’imbibition de la graine (levée de dormance) se sont considérablement réduites en intensité ou inhibées complètement. En analysant l’activité des estérases sur 5 génotypes de bananier, soumis à différentes concentration de sel, waked Ferreira Gomes et al., (2002) montrent que les profils des estérases ne présentaient pas de bandes consistantes pour aucun traitement. Par contre, Reyes 67 Expérimentation résultats et interprétation et al., (1998) avaient détecté un total de 14 bandes réparties en 5 zones d’activité enzymatique, en analysant les feuilles de 15 clones du genre Musa provenant de culture in vitro, ce qui indiquerait que ces bandes pourraient être activées au cours d’autres phases de développement de la plante. Zou et al., (2007) présentent une étude sur le système d’estérase en relation avec un stress de froid, montrant que chez deux variétés de Brassica napus L, l’une tolérante AS-3 et l’autre sensible CON, l’activité des estérases s’accroit sous l’effet de stress chez les deux variétés. Mais cette suractivité est plus importante chez la variété tolérante que chez la variété sensible. Les mêmes résultats ont été trouvés par Puneva et al., (1995) qui ont constaté que l’augmentation de l’activité des estérases dans les cellules du tabac traité est liée à un stress de basse température (froid et gèl) relativement à 4°C et 10°C. Tamas et al., (2005) étudiant les effets d’un stress par l’Aluminium, au niveau de système racinaire de l’orge, ont montré que des concentrations de 2 et 4 mM d’Aluminium engendrent une augmentation de l’activité estérasique en comparaison avec le témoin. Ces mêmes auteurs stipulent aussi que sous stress deux isoenzymes d’estérase sont synthétisées avec une augmentation considérable de cette activité par rapport au témoin. D’autre part, ils ont conclu que la variation des estérases constitue un marqueur potentiel pour étudier la pollution par l’Aluminium. Par ailleurs, l’effet du sel sur l’activité enzymatique des estérases apparait plus nettement lorsqu’on compare l’intensité des bandes des lots traités avec celles des témoins (Moulai, 2009). Dans notre étude, L’expression des estérases durant 9 jours de germination des écotypes d’Aculéata est similaire à celle de l’écotype de Truncatula avec une différence dans les Rf, du nombre de bandes et de leur intensité. Cette différence est due aux polymorphismes génotypiques des espèces annuelles de Medicago. Des études de diversité réalisées à l’aide 68 Expérimentation résultats et interprétation des isozymes ont révélé un polymorphisme très élevé chez la canne à sucre, fournissant une méthode d’identification des variétés cultivées (Eksomtramage et al., 1991). L’analyse des différentes espèces a suggéré que l’essentiel du polymorphisme existant entre les clones cultivés, est dû à des bandes caractéristiques que l’on pourrait suivre à l’aide d’un petit nombre de marqueurs spécifiques (Seguin, 1993). L’expression de l’activité des estérases est lié au stade de développement de la plante certaines bandes ont été révélées dans le premier jour de germination et disparaissent dans les jours suivants telle que les deux bande de troisième jour (EST-1 et EST-2) de l’écotype Tru 32, EST-1 chez l’écotype Tru 40, EST-3 chez l’écotype Acu 209 et l’écotype Acu 80. Ce sont des bandes spécifiques qui caractérisent ce jour, ou ce stade de ces écotypes par rapport aux autres jours. Ce résultat est similaire à celui de Yurenkova et al., (1995) Ram et al., (1977). Par contre, on trouve des bandes constitutive qui apparaissent pendant tous les jours de croissance et même sous le stress salin tel que EST-8, EST-9, EST-10, chez l’écotype Tru 32 Figure (6(a), 7 (a) ) et EST-7 , EST-8 chez Tru 40 ( Figure 6 (b), 7 (b) ). La comparaison intrapopulation des profils traités aux profils témoins des écotypes âgés de 9 jours, montre des différences qualitatives et quantitatives. Ces différences sont résumées dans un retard de croissance en fonction de la concentration, en fonction de la tolérance et de la sensibilité des écotypes étudiés. En effet l’écotype Tru 32 présente un nombre élevé d’activité enzymatique (11 bandes) par rapport à l’écotype Tru 40 (9 bandes). Sous un régime de stress salin de 86 mM /l (T1), Tru 32 a révélé 3 bandes esterasiques, donc l’augmentation de stress a entraîné une augmentation de l’activité esterasique. En conséquence, les lots traités (T2 et T3) ont exhibé deux bandes en plus (Est-3et Est-4) respectivement les mêmes bandes ont été trouvées dans le lot du 9eme jour avec des variations quantitatives seulement. Par contre, l’écotype sensible a révélé l’existence de trois bandes 69 Expérimentation résultats et interprétation (Est-7, Est-8 et Est-9) quelle que soit la concentration de stress ; les mêmes résultats ont été trouvés par Tamas et al., (2005). L’écotype tolérant Aculeata 209 a montré l’existence de 2 zones d’activité estérasique sous une concentration de 86Mm/ l le même phénomène est remarqué chez Tru 32. Cette activité est accrue par l’augmentation de la concentration de NaCl avec l’existence de 3 zones d’activité des estérases similaire à celle du 1er jour témoin, et par conséquent nous remarquons un retard de 9 jours. Pour l’écotype sensible Acu 80 nous notons l’existence de 2 zones d’activités seulement. Les profils observés chez les plantules traitées par T2 et T3 durant 9 jours, montrent une intensité des bandes légèrement plus importante que celles observées chez les plantules témoins avec la disparition EST-1, EST-2, EST-3 et EST-4. Cette observation nous permet de suggérer qu’il est possible que des modifications quantitatives soient survenues comme réponse à ces niveaux sévères de stress salin. Ces résultats sont similaires à ceux d’Amal, (2005) qui a conclus qu’une forte activité des isoformes estérases est liée à une concentration élevé de NaCl. Au contraire, les résultats trouvés par Hassanein, (2004), lors de la régénération des cals de L.esculentum, sous un stress salin, montrent que l’activité des estérases diminue sous l’effet de sel, et cette diminution est accompagnée aussi d’une disparition des autres bandes estérasiques. Si l’on considère une comparaison inter population entre les quatre écotypes étudiés sous le terme de la quantité d’estérases révélée après les trois traitements par le stress salin on remarque que l’activité des estérases est plus élevée chez Tru 32 que chez Acu 209 et cette même activité est plus élevée chez Acu 80 que chez Tru 40. Par conséquent, Tru 32 est plus tolérante qu’Acu 209, Tru 40 est plus sensible qu’Acu80. Nous n’avons pas trouvé de travaux similaires aux nôtres, de sorte que, nous ne pouvons les comparer aux résultats d’autres auteurs qui ne concernent que l’apparition ou/et la disparition des estérases chez d’autres variétés de plantes. 70 Expérimentation résultats et interprétation Les résultats obtenus à l’aide de ce système, montrent d’une part, la possibilité de l’identification phénotypique entre les deux écotypes extrêmes âgés de 9 jours, d’autre part d’évaluer l’effet du stress salin sur l’activité enzymatique durant 9 jours d’extraction. Ainsi, l’étude des Rfs permet de déceler des bandes discriminantes en fonction de l’écotype, des traitements et du stade de prélèvement pour l’extraction qui correspond à l’âge des plantules. Finalement, on peut conclure que les profils observés chez les plantules traitées durant 9 jours par les concentrations T1, T2 et T3, montrent une intensité plus importante que celle observée chez les plantules des lots témoins avec une disparition des bandes d’estérases de Rf 0.12, 0.16, 0.37, 0.43 et 0.89 les même résultats obtenus par Hassanien, 1999 qui a trouvé que l’ activité des estérases augmente par l’augmentation de stress salin . Cette observation permet de supposer qu’il est possible d’avoir des changements quantitatif (par rapport à l’intensité de bandes) qui surviennent comme réponse lors du stress. VI. 2. Modifications des peroxydases sous un stress salin. Les peroxydases sont des enzymes hémoprotéiques très répandues chez les être vivants. Chez les plantes, elles catalysent l’oxydation de différents substrats (des amines aromatique des phénols,…….), elles interviennent ainsi dans différents phénomènes physiologiques tels que l’enracinement, la lignification, et la résistance aux stress biotiques et abiotiques (Gaspar et al., 1991. ; Aouad et al., 1997). La méthode d’extraction par solubilisation permet d’avoir accès à la totalité des peroxydases (PER) contenues dans le matériel végétal et renseigne mieux sur la diversité de ces oxydoréductases, tout en concervant leur propriétés physico-chimiques (Bazziz, 1990 et Majourhat, 2002). Waked.E et al., 2002 ont établi trois types de traitements en faisant varier les concentrations du NaCl additionné à la solution nutritive: 0 ; 50 et 100 mol/m3 ;il en a résulté degré de polymorphisme plus élevé, soit 15 bandes au total chez des variétés de bananier. 71 Expérimentation résultats et interprétation D’autres chercheurs (Jarret et al., 1986 ; Bhat et al., 1992), en travaillant sur d’autres génotypes, ont enregistré diverses zones d’activité très polymorphique chez le bananier. Irié Z et al., 1999 ont affiché l’existence de quatre à six bandes d’activité peroxidasique chez la variété haricot de L’ima, et ont conclu qu’au moins deux gènes contrôlent cette isoenzyme. Abdel-Baki et al., 2003 ont trouvé l’existence d’une seule bande d’activité peroxydasique chez trois variétés d’oignon ( Allium ceba L.) La densité et l’intensité de cette bande sont plus fortes sous des concentrations élevées (2000, 4000, 6000 ppm) du sel, ils ont conclu que le stress salin a augmenté l'accumulation de la peroxydase et que le gène codant pour cette isoenzyme a accéléré son expression en réponse à ce stress. L’électrophorèse des peroxydases chez le Maïs (Zea mays L) soumise à des concentrations différentes de NaCl, a montré quatre zones d’activité peroxydasique (Amel, 2005). Les résultats contrastés entre les génotypes étudiés sont en relation avec leur capacité d’adaptation et de croissance en milieu salin, laquelle, à son tour, est contrôlée par des facteurs génétiques. Errabii (2006) a également étudié l’effet de NaCl sur l’activité enzymatique à l’échelle cellulaire d’une variété de canne à sucre. Ses résultats ont montré une réduction importante de l’activité catalase et peroxydases solubles. Karray-Bouraoui, 2008 a étudiée les réponses physiologiques et biochimiques de deux provenances de la Mentha. pulegium L. (Lamiaceae) « Soliman et Takelsa » vis-à-vis du stress salin. Les deux provenances du nord tunisien ont été traitées par le NaCl (0 et 35 mM) Après deux semaines de traitement, le sel a entraîné une réduction de la croissance, de 16 % par rapport à celle du témoin chez la première provenance, et de 25 % chez la seconde. L’activité de la Gaïacol peroxydase n’est pas modifiée par le traitement salin de courte durée (15 jours) dans les feuilles, et elle est même diminuée à plus long terme, chez les deux provenances. Par contre, une stimulation de cette activité par le traitement salin est notée dans 72 Expérimentation résultats et interprétation les racines, et elle est légèrement plus marquée chez la provenance « Soliman » surtout après une longue durée de traitement (45 jours). Chakroun et al., 2007 ont constaté que l’activité peroxydasique n’est détectable qu’en présence de NH4NO3 (agent de stress aux doses de 500, 1000 et 1500 mg.l-1) ajouté au milieu nutritife de deux variétés de fraisier « Chandler » et « Sweet Charlee » respectivement sensible et tolérante). L’activité chute toutefois de plus de la moitié de sa valeur lorsque la quantité de sel passe de 500 mg.l-1 à 1500 mg.l-1 dans le milieu de culture, la supériorité de l’activité peroxydasique chez la variété « Sweet Charlee » est plus évidente. L’analyse du profil électrophorétique de cette activité peroxydasique montre que l’addition de nitrate d’ammonium dans le milieu de culture induit l’apparition d’isoformes anodiques non détectables en l’absence de nitrate d’ammonium. L’extraction par solubilisation progressive des peroxydase des 5 écotype d’O.f.i( Opuntia Ficus Indica L.) traités par le stress salin, menée par Bazziz, 2006, a permis de révéler que le stress salin provoque une augmentation des peroxydases dans les fractions solubles et ioniques préparées à partir d’écotypes tolérants. Ces changements sont reflétés au niveau des profils électrophorétiques par l’apparition d’isoformes acides et basiques chez les écotypes dont la croissance n’est pas affectée par le sel. Ce même auteur a enregistré des changements quantitatifs dans l’activité des peroxydases. L’augmentation significative de l’activité de cette isoenzyme est enregistrée chez tous les écotypes, tolérants et sensibles, en condition de stress. Le degré d’augmentation de cette activité dépend de la sévérité et de la durée du stress. Des travaux de Rodrigué et al., (2000) ont rapporté que l’augmentation du niveau d’une isoperoxydase anionique induite par la salinité peut-être reliée à l’augmentation de la fermeté du melon, en conditions salines. 73 Expérimentation résultats et interprétation Les travaux de Zou et al., (2007) ont montré que l’activité des peroxydases, s’accroit sous l’effet de stress froid chez les deux variétés étudiées. Mais cette augmentation est plus importante chez la variété tolérante que shez la variété sensible. Amal, 2005 a trouvé aussi une forte activité des peroxydases chez des variétés tolérantes de maïs soumis à une concentration de 150 mM de NaCl. En examinant l’effet du stress salins modéré (50, 100, 150,200 Mm) sur l’activité des peroxydases chez des variétés de blé durant leur stade de développement (96h, 168h, 240h) Lacramioar et al., (2008), ont trouvé que l’activité des peroxydases est faible dans des concentrations faible de NaCl, et forte sous des concentrations forte de NaCl. Ils ont conclus que le stress salin a modifié l’activité des peroxydases, cette modification dépend des variétés du blé, de l’âge des plantules et de la concentration de NaCl. Chez le coton, le stress salin a causé une augmentation considérable dans l’activité de peroxidase chez les variétés tolérants, alors qu’ elle est faible, ou reste inchangeable chez les variétés sensibles( Gossett et al., 1996). Dans une autre étude, Mitova et al., 2002 ont comparés le comportement de quelque variétés de tomate vis-à-vis le stress salin, ont trouvés que la variétés ( L.pennelli) présente la meilleure vigueur de tolérance avec une augmentation de l’activité peroxydasique par apport au variétés sensibles. En contraste Dionososese et al., (1998) ont rapporté une augmentation dans l’ activités peroxydasique sous un regime de stress salin, chez les variétés sensibles du riz que les variétés tolérantes. Les résultats des électrophorèses des peroxydases n’apparaissant pas bien nets malgré plusieurs tentatives, nous exposons dans cette partie les meilleurs résultats obtenus que nous tenterons d’interpréter. 19 bandes au total ont été révélées (4 bandes chez les variétés Tru 32 et 5 bandes chez Tru 40, 4 bandes chez Acu209 et 6 bandes chez Acu 80). D’après les figures (10, 11, 12 et 13), les profils électrophorétiques du système Peroxydase, chez les écotypes tolérants (Tru 32 et Acu 209), et les écotypes sensibles (Tru 40, 74 Expérimentation résultats et interprétation et Acu 80), nous remarquerons une activité d’expression variable pendant les neuf jours de développement. Cette activité différera dans le temps, certains bandes apparaissent pendant les premiers jours et disparaissent par la suite pour que d’autres prennent le relai. Le nombre de bandes varie chez le génotype Tru 32 de 1 à 2 bandes par profil. La bande PER-3 du le 1er jour de germination a disparu au cours des autres jours et réapparait le 5eme jour avec une faible intensité. Le lot 3j, celui des plantules âgées de 3 jours, montre la présence d’une nouvelle bande PER-1 d’une faible intensité. Les deux bandes précédentes apparaissent dans le 5eme jour de croissance ce qui fait un total de 2 bandes dans cette zone. La bande correspondant au PER-1 persiste jusqu’au 9eme jour. Parmi les bandes de peroxydase détectées, trois (PER-1, PER-4 et PER-3) ont été respectivement observées chez Tru40 et Tru32 et des bandes du Rf 0.05, 0.32 et 0.10, respectivement chez Acu209 et Acu80 indépendamment du traitement auquel avaient été soumises les plantes. C’est seulement dans le traitement par le sel que s’est révélée la bande PER-4 chez Tru 32 et PER-3, PER-5 chez Tru 40, elles sont peut être dues à une enzyme marqueur de stress. Chez Acu 209 ne présente pas des bandes nouvellement synthétisées, par contre chez Acu 80 nous avons la révélation de nouvelles bandes (PER-3, PER-5 et PER-6), donc d’une part, le sel a induit l’activation de ces bandes et d’autre part, il a entrainé un retard dans l’expression de cet enzyme ; en effet, chaque profil traité des quatre écotypes ne correspond pas au profil du neuvième jour du témoin. Le stress salin a induit l’activation de nouvelles bandes sous des concentrations de 68.6 mMol/l, 102.9 mMol/l chez les écotypes sensibles (Tru 40 et Acu 80) contrairement aux écotypes tolérantes, ces résultats sont similaire aux résultats de Dionososese et al., 1998 pressedament décrite, et sont contraste aux résultats des autres chercheurs qui ont trouvé que l’élévations des activités des peroxydases est plus importante chez les écotypes tolérants. 75 Expérimentation résultats et interprétation Les résultas de l’extraction journalière des peroxydases durant les neuf jours de germination des graines traitées et témoins, chez l’écotype sauvage de Medicago nous a amené à suggérer que d’une part l’augmentation de l’intensité des bandes peroxydasiques est liée à l’augmentation de la concentration du sel (T1, T2 et T3). D’autre part, nous avons observé que le neuvième jour traité des trois concentrations (T1, T2, T3) ressemble beaucoup au 6eme jour témoin, ce qui nous permet de conclure que le stress a entraînée un retard d’activité enzymatique de 3jours. Par ailleurs, la bande PER-2 qui a été révélée au 7eme jour témoin montre une plus forte intensité dans les trois lots traités (T1, T2, T3) ainsi qu’une accélération précoce de son expression par rapport aux jours des lots témoins. En fonction de la concentration de sel, elle a été révélée au 5eme jour de T1, au 3eme jour de T2 et T3. Alors elle est peut être due à une enzyme liée au stress salin. (abdel-baki et al., 2003). Le stress a accéléré aussi l’activation de la bande PER-1. 76 Conclusion Conclusion et Perspective : La résistance au sel apparaît comme un caractère polygénique contrôlé à différents niveaux d’organisation, de la cellule à la plante entière. La grande variabilité manifestée par les espèces et les variétés pour ce caractère, permet d’envisager la sélection de génotypes particulièrement bien adaptés au stress salin. Par ailleurs, la diversité des effets du sel offre une gamme étendue de critères physiologiques et biochimiques qui peuvent être à la base de tests rapides, utilisables pour un tri à grande échelle. En effectuant un grand nombre de techniques d’électrophorèse, sur les deux espèces, M. truncatula et M. aculeata, des différences interpopulation et intrapopulation importantes sont relevées, ce qui offre des possibilités de sélection de certaines populations pour une meilleure adaptation à la salinité. Il serait peut-être intéressant d‘utiliser des techniques basées sur la description du comportement, l‘analyse génétique des caractères et la recherche des marqueurs moléculaires pour une amélioration de la tolérance au stress salin. La présente étude, basée sur les données recueillies au cours de plusieurs années, est réalisée dans le but de rechercher des marqueurs génétiques liés à la tolérance à la salinité chez des espèces annuelles de Medicago, et de déterminer s’il existe une différence d’activité enzymatique entre les plantes témoin et traitée, sensible et tolérants. Au terme des résultats trouvés, nous pouvons conclure que la présence du stress salin semble altérer le métabolisme normal des deux isoenzymes (estérases et peroxydases) en retardant leur activité. D’une part le stress a induit l’activation de nouvelles peroxydases, chez les écotypes sensibles par rapport aux tolérants (changements qualitatifs et quantitatifs) et à accéléré la synthèse des autres ; d’autre part, les profils des estérases présentent des variations d’ordre qualitatif se traduisant par une forte intensité des bandes chez les individus traités. En général, les aspects quantitatifs et qualitatifs des peroxydases et des estérases peuvent être utilisé comme des marqueurs de résistance des plantes à plusieurs contraintes biotiques et 77 Conclusion abiotiques. Leurs activités peuvent être un bon indicateur pour la sélection des génotypes tolérants au stress. Au-delà de ces résultats, le rôle exact joué par ces enzymes demande encore plus d’investigations. Enfin, la recherche des marqueurs iso enzymatiques liés à la tolérance à la salinité peut être exploitée dans la sélection de nouvelles lignées tolérantes au stress salin. En repérant ces marqueurs de tolérance, il est possible de remonter au niveau des gènes correspondants afin de localiser les zones du génome impliquées dans la variation de ce caractère de tolérance au stress salin. 78 Références Bibliographiques -Abd El-baki H., Hanaa M., Amal A et Hussein M.M. 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