8. Chromatographie de pigments verts
publicité
Travaux Pratiques de Chimie Organique Nadia BOULEKRAS Chromatographie de pigments verts I. INTRODUCTION Les organismes chlorophylliens sont capables de synthétiser des molécules organiques simples sous l’action de la lumière visible. Cette synthèse nécessitant la lumière comme source d'énergie s'appelle la photosynthèse. L'utilisation de l'énergie lumineuse est rendue possible grâce à l'existence de pigments : molécules capables d’absorber certaines longueurs d'onde lorsqu'ils sont éclairés par de la lumière blanche. Cette propriété leur donne une couleur déterminée. La chlorophylle (mot grec composé chlorós : vert et phýllon : feuille) est le principal pigment constituant des végétaux photosynthétiques. La chlorophylle est contenue dans les chloroplastes : de minuscules organismes situés dans les essentiellement dans les feuilles. cellules végétales vivantes, La chlorophylle est constituée de plusieurs molécules de structures chimiques très proches : les chlorophylles a, b, c et d, les xanthophylles et les caroténoïdes. Les chlorophylles a et b sont les plus abondantes chez les plantes supérieures et algues vertes, en proportions variables suivant l’espèce. Les chlorophylles c et d sont présentes chez les algues brunes et cyanobactéries. o Chlorophylle a (vert-bleu) : 7 Travaux Pratiques de Chimie Organique o Chlorophylle b (vert-jaune) : o Phéophytine (vert-olive) o β-Carotène (jaune-orangé) : o α-Carotène (orange) : 8 Nadia BOULEKRAS Travaux Pratiques de Chimie Organique o Nadia BOULEKRAS Lutéine (jaune) OH HO o Xanthophylles (jaune) : • Viola xanthine OH O O HO • Néo xanthine HO OH OH O Remarque : toutes ces molécules contiennent des liaisons doubles conjuguées qui sont essentielles pour l’absorption et le transport de l’énergie lumineuse. En automne, la dégradation des chlorophylles a et b provoquent un changement de couleur des végétaux : les feuilles des arbres perdent leur teinte verte et prennent des couleurs allant du jaune au rouge sombre. Sous l’action d’enzymes, la chlorophylle verte se transforme en des molécules rouges puis incolores. Les autres pigments de la plante, les caroténoïdes (jaune-orange) ne seront plus cachés par le vert de la chlorophylle et seront responsables de la couleur rouge (ou jaune) que prendra la feuille. II. PRINCIPE Les pigments que l'on rencontre dans les feuilles des plantes vertes sont facilement séparés par chromatographie. Ils sont extraits par un solvant organique (l’éthanol : CH3CH2OH ou l’acétone CH3COCH3). L'extrait est analysé par chromatographie sur couche mince (C.C.M). 9 Travaux Pratiques de Chimie Organique Nadia BOULEKRAS Les chlorophylles : sont très solubles dans les solvants polaires. Les xantophylles: ont une solubilité plus ou moins importante dans les solvants polaires, mais elles sont aussi solubles dans les solvants apolaires. Les carotènes: ne possèdent aucun groupement polaire et sont solubles dans les solvants apolaires. III. MODE OPÉRATOIRE : Pour 3 binômes • • • • • • • Prendre 5 feuilles d’une plante verte, les rincer à l’eau distillée puis les sécher avec du papier absorbant. Choisir la partie vert foncée, enlever les nervures et les tiges, puis les couper finement. Mettre les feuilles coupées dans un mortier puis ajouter une spatule de sable (qui facilite le broyage) et 10 mL d’acétone (ou d’éthanol). Broyer à l'aide du pilon jusqu'à ce que le solvant prenne une couleur vertfoncé. Filtrer la solution sur papier filtre (ou Büchner) : le filtrat obtenu doit avoir une couleur vert limpide. Evaporer le solvant à l’évaporateur rotatif (ou en chauffant modérément au bain-marie) : on obtient une pâte de couleur vert-foncé. Réaliser une chromatographie sur couche mince. Feuilles après broyage Filtrat après broyage Après évaporation du solvant IV. CHROMATOGRAPHIE Séparation par CCM des différents pigments colorés contenus dans les feuilles des plantes vertes a) Préparation de la cuve : L'atmosphère de la cuve doit être saturée en vapeur d'éluant. Ceci impose d'avoir une cuve bien fermée et préparée à l'avance. Sous la hotte, verser l’éluant dans un bécher sec de 100 mL, sur une hauteur de ½ cm. Recouvrir la cuve avec une boîte à pétri : • • • • Eluant Eluant Eluant Eluant 1 2 3 4 : : : : Ether de pétrole/Acétone/Cyclohexane : 85/10/5% Ether de pétrole/Ethanol : 90/10% Ether diéthylique/Ether de Pétrole : 60/40% Ether diéthylique/Cyclohexane: 70/30% 10 Travaux Pratiques de Chimie Organique Nadia BOULEKRAS b) Préparation de la plaque chromatographique : o o o o Prendre une plaque d’aluminium recouverte de toucher avec les doigts. Découper avec un cutter, une plaque de (5 cm x 3 Tracer au crayon sans appuyer, une ligne (ligne cm du bord inférieur de la plaque. Marquer légèrement au crayon sur cette ligne, du dépôt. silice. Ne pas cm). de dépôt), à 1 l’emplacement c) Dépôt de l’échantillon : o o o A l’aide d’une pipette pasteur, d’un tube capillaire ou d’un curedent, prélever une goutte d’extrait vert, la déposer à l’emplacement marqué. Laisser sécher avant d’effectuer un nouveau dépôt. Effectuer une dizaine de dépôts au même endroit, en laissant sécher entre chaque dépôt. d) Elution : o o o o Lorsque les dépôts sont secs, introduire la plaque verticalement dans la cuve (la ligne de dépôt ne doit pas tremper dans l’éluant) et refermer à l’aide de la boîte à pétri. Au cours de l’élution, l’éluant migre sur la plaque en imprégnant la silice. Retirer la plaque de la cuve avec des pinces, lorsque le front du solvant est à 1 cm du bord supérieur de la plaque. Repérer le front du solvant au crayon. Laisser l’éluant s’évaporer sous la hotte. e) Révélation (développement du chromatogramme): Observer le chromatogramme et entourer au crayon, les différentes tâches colorées qui apparaissent. f) Analyse du chromatogramme : On met en évidence 4 sortes de pigments, du haut vers le bas : • • • • Carotènes (jaune-orange) : très peu polaires. Chlorophylle A (vert-bleu) : peu polaire. Chlorophylle B (vert-jaune) : moyennement polaire. Xantophylles (jaune) : polaires. 11 Travaux Pratiques de Chimie Organique Nadia BOULEKRAS Remarque : lorsque les taches sont incolores, on les fait apparaître sous une lampe UV ou à l'aide d'un révélateur chimique mais dans le cas des pigments, ils apparaissent sous forme de taches colorées, visibles à l’œil nu. o Les xantophylles (violaxanthine et néoxanthine) : sont des carotènes oxydés, ils sont polaires puisqu’ils comportent de nombreux atomes d’oxygènes qui vont pouvoir se lier avec les groupements hydroxyles (–OH) du support solide. o Les chlorophylles a et b : sont des composés peu polaires. La chlorophylle b se différencie de la chlorophylle a par la présence un groupement aldéhyde (-CHO) au lieu d’un méthyle (CH3). La chlorophylle b est donc plus polaire et plus retenue par le support solide que la chlorophylle a. o Les carotènes (β-carotène) : sont des composés apolaires, ne comportant pas d’atome d’oxygène et ne sont donc pas retenus par le support solide. g) Rapport frontal : On appelle rapport frontal Rf d'une espèce chimique, le rapport entre la distance x parcourue par l'espèce et la distance y parcourue par l'éluant pendant le même temps. Rf dépend de la nature du produit, de l'éluant et de la phase fixe. Rf = dis tan ce parcourue par la susbs tan ce dis tan ce parcourue par l' éluant 12 = x y Travaux Pratiques de Chimie Organique V. Nadia BOULEKRAS COMPTE RENDU • • Reproduire le chromatogramme obtenu. Identifier chaque pigment, en utilisant les indications données ci-dessus. Calculer les différents rapports frontaux. • Comparer le chromatogramme obtenu à partir du pigment vert avec celui du paprika : Y a-t-il une substance commune aux deux extraits? • Quelle est la technique qui nous permet de révéler le résultat d’une CCM lorsque les produits ne sont pas colorés ? • On a broyé des feuilles de persil que l’on répartit dans 2 béchers : 5 mL d'eau 5 mL d'éthanol Feuilles de persil broyées On agite, on laisse agir, puis on filtre dans 2 tubes à essai. On constate que : dans le 1er tube, la couleur du filtrat est à peine verte (presque incolore). dans le 2ème tube, la couleur du filtrat est vert foncé. Quel est le meilleur solvant pour la chlorophylle ? Références • • http://scienceamusante.net/wiki/index.php?title=La_chlorophylle http://fr.wikipedia.org/wiki/Chlorophylle 13
