P Corbeau
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Thérapie génique Pierre CORBEAU UF d’Immunologie du CHU de Nîmes Département d’Immunologie du CHU de Montpellier Institut de Génétique Humaine du CNRS, Montpellier Définition Comment ? (vecteur) Transfert de matériel génétique à des cellules spécifiques d’un patient dans le but de prévenir ou de corriger un état pathologique. Cible ? (cellule) Mécanisme ? (transgène) Historique 1990 - Cancer - TNF (Rosenberg) 1990 - Maladie (Andersen) génétique 2000 - SCID - γc (Fischer) - ADA Champ d’application Cancérologie: immunostimulati on inhibition gène suicide Maladies génétiques Inflammation Maladies infectieuses Pathologies cardio-vasculaires Neurologie Ophtalmologie Dermatologie Douleur Vieillissement Champ d’application Etapes 1 - Administration In vitro: sécurité spécificité In vivo 2 - Transfert du transgène du site d ’ administration au noyau des cellules cibles 3 - Expression du transgène Transgène Cellules cibles Niveau d’expression Ajout/Remplacement 1 - Mécanisme Inhibition Nouvel effet Autocrine 2 - Effet Paracrine Allocrine Niveau 3 - Expression Durée Cellules cibles: nature, % Promoteur Mécanisme d’action du transgène Ajout/Remplacement Inhibition Nouvel effet Thérapie génique anti-VIH Patient de Berlin allogenic Chemiotherap CCR5∆ ∆32 CD34+ cell graft y M7 M18 M20 M23 M30 M35 M60 HIV RNA AML AML Blood: antiHIV T cell response - Rectum: Liver: CCR5 CD4 T cell CCR5 Mφ φ+ HIV DNA - CCR5 CD4 T cell - Liver, colon: CCR5 Mφ φ- Blood: CCR5 CD4 T cell HIV DNA - Brain: CCR5 Mφφ – HIV DNA - Bone marrow: HIV RNA - HIV DNA - Remplacement: nucléases à doigt de zinc CCR5 knockdown in HIV infection Nuclease Zinc finger CCR5 Nuclease Gene transfer Stem cells and/or CD4 T cells Expansion Re-infusion + CRISPR-Cas9 technology + Transcription-activator-like effector nucleases (TALEN) Inhibition: siRNA cytoplasme noyau P-body RISC mRNA shRNA siRNA shRNA miRNA TRBP X mRNA Inhibition: shRNA CCR5 knockdown in HIV infection Anti-CCR5 shRNA Gene transfer Stem cells and/or CD4 T cells Expansion Re-infusion Transgènes ciblant l’ARN: saut d’exon Exemple : myopathie de Duchenne 22 23 24 X X C→T C→T 22 24 X Codon STOP Dystrophine tronquée non fonctionnelle Dystrophine fonctionnelle Transgènes ciblant l’ARN: inclusion d’exon Exemple : amyotrophie spinale Antisens de la séquence d’ARN de SMN2 + site de liaison à facteurs d’épissage Transgènes ciblant l’ARN: Trans-épissage 9 10 11 12 13 X X 9 10 11 12 10 11 12 15 X 13 X X 9 14 14 15 X 13 X X ARN CFTR sauvage 14 X 15 Cible Cellules somatiques germinales et non cellules Accessibilité 1 - Nature Permissivité - vecteur - promoteur Transfert 2 - Sélectivité Expression Ciblage 1 - Site d’administration 2 - Tropisme cellulaire mutation de l’enveloppe couplage pseudotypage 3 - Restriction transcriptionnelle promoteur spécifique promoteur inductible par protéine pathologique mutation couplage pseudotypage Ciblage 1 - Site d’administration 2 - Tropisme cellulaire mutation de l’enveloppe couplage pseudotypage 3 - Restriction transcriptionnelle promoteur spécifique promoteur inductible par protéine pathologique Promoteur inductible par protéine pathologique LTR Toxin Vecteur VIH Tat Toxin Vecteur idéal 1 - Assure l ’ expression suffisante (transitoire/continue/régulable) du transgène dans des cellules spécifiques 2 - Sécurité 3 - Productible quantité en grande Vecteur Local 1 - Ex vivo / In vivo Systémique Virale 2 - Nature Non virale Vecteurs les plus utilisés actuellement 1 – Rétrovecteurs, dont lentivecteurs 33% 2 - Plasmides 19% 3 – Adénovecteurs 15% 4 – Vecteurs Associated dérivés d’Adenovirus Virus (AVV) 8% Vecteurs rétroviraux Famille des Rétrovirus Avian sarcoma and leukosis 1 - Oncorétrovirus Mammalian B-type Murine leukemia HTLV, BLV D-type (MPMV) 2 - Lentivirus Moloney murine leukemia virus vectors 3 - Spumavirus Lentivecteurs Spumavecteurs Avantage des lentivecteurs 1 - Transduction de cellules ne se divisant pas 2 - Stabilité d’expression Cycle de réplication du VIH CD4 CCR5 Entrée ARN Rétrotranscription ADN Intégration Expression Production Encapsidation du génôme VIH Ψ Ψ Ψ− X Production de VIH sans ARN Ψ− Ψ− Ψ− Encapsidation de l’ARN transgénique dans un virion VIH Ψ Transgène Ψ− Ψ− Ψ Transgène Ψ− Ψ Transgène Ψ Transgène Ψ Transgène Ψ Transgène Pseudotypage 1 - Virus de la stomatite vésiculaire 2 - Ebola cellules épithéliales bronchiques 3 - Rage neurones myocytes Production d’un vecteur VIH Enveloppe Ψ Transgène Ψ− Enveloppe Ψ− Ψ Transgène Enveloppe Ψ− Ψ Transgène Ψ Transgène Ψ Transgène Ψ Transgène Transfert de gène avec VIH Ψ Transgène Transgène Transgène Molécule thérapeutique Cellules cibles 1 - Cellules souches 2 - Cellules nerveuses 3 - Cellules épithéliales: rétine, bronches 4 - Fibroblastes: synoviocytes 5 - Hépatocytes 6 - Myocytes 7 - T, B, cellules dendritiques, macrophages 8 - Cellules embryonnaires VIH comme outil de transfert de gène: applications 1 - maladies génétiques 2 - maladies neurologiques 3 - maladies infectieuses 4 - maladies inflammatoires 5 - animaux transgéniques 6 - maladies ophtalmologiques Types de lentivecteurs HIV-1, HIV-2 1 Primates SIV FIV EIAV 2 - Non primates CAEV Visna BIV + Spumavecteurs Limites 1 - RCR Réduire les séquences homologues Lentivirus non pathogènes 2 - Mutagénèse insertionnelle 3 - Recombinaison endogènes avec rétrovirus 4 - Titre 5 – Ciblage Intérêt dans la thérapie génique ex vivo Exemple: Thérapie génique de l’adrénoleucodystrophie MALADIE: Gène ABCD1 codant pour une protéine impliquée dans la dégradation des acides gras à très longues chaînes au niveau des oligodendrocytes et de la microglie -> démyélinisation TECHNIQUE: Transduction ex vivo du gène sauvage dans des cellules CD34+ avec un vecteur VIH – myéloablation – ré-infusion RESULTAT: 10% PBMC expriment le transgène à 2 ans Pas de clonalité Stabilisation, voire régression des signes cliniques et radiologiques Science 326:818, 2009 Vecteurs adénoviraux 1 - Virus à ADN non enveloppé non intégratif -> infections respiratoires, digestives, neurologiques 2 - Vecteurs: - 1ère génération: délétion E1 ± E3 production dans cellule E1+ - 2ème génération: délétion E1 ± E3 ± E2 ± E4 taille transgène (> 8 kb) toxicité - 3ème génération « gutless »: délétion des gènes viraux pb contamination OPH, Vecteurs adénoviraux 3 - Avantages: - titre élevé - stabilité, résistance au complément - grande capacité - tropisme large (cellules amitotiques) - non intégré 4 - Inconvénients: - transitoire - inflammation - immunogène - contamination/recombinants Vecteurs adénoviraux 5 - Applications: - cancer : oncolyse due à cytopathogénicité virale et à immunogénicité +/- transgène renforçant la réponse immunitaire anti-tumorale ex: GM-CSF - athérothrombose: injection intra-coronarienne / intramyocardique / intra-musculaire pour délivrer facteurs de croissance (VEGF, FGF, HGF) - vaccins : HIV, influenza Vecteurs AAV 1 - Parvovirus à ADN - défectif -> virus « helper » - non pathogène - site d’intégration spécifique (ch 19) 2 - Vecteurs: délétion des gènes viraux et production dans cellule produisant les protéines AAV et infectée par adénovirus - plus d ’ intégration spécifique, mais circularisation augmentant la stabilité sous forme épisomique - taille transgène < 4,5 kb Vecteurs AAV 3 - Avantages: - virus non pathogène et défectif - vecteur délété des gènes viraux - vecteur stable - tropisme large (cellules amitotiques) - expression continue - intégration: spécifique ou absente (ou lente) 4 - Inconvénients: - faible capacité transgène divisé en 2 - pré-immunisation mutations d’Ag dominants - contamination - transduction de cellules non ciblées choix du sérotype selon son tropisme, mutations - ADN AAV retrouvé transitoirement dans le sperme dans un essai de thérapie génique Vecteurs AAV 5 - Applications: ciblage - système nerveux - rétine - épithélium - cellules souches - myocarde 5 – 1 - Le tropisme est en grande partie déterminé par la capside les différents sérotypes ont des tropismes différents Ex : AAV9 sytème nerveux central 5 – 2 – Adjonction de peptides 5 – 3 – Constitution d’une banque de capsides chimériques Intérêt dans la thérapie génique in vivo Vecteurs AAV 1er vecteur autorisé sur le marché = vecteur AAV, en Novembre 2012 Déficit génétique en une enzyme (lipoprotein lipase, LPL) du catabolisme des graisses pancréatite Vecteur AAV1 contenant un gène LPL hyperactif, injecté une fois en intramusculaire production de LDL qui se fixe sur cellules endothéliales et catabolise les graisses + Immunosuppression de J-3 à J84 pour prévenir l’élimination du vecteur Vecteurs AAV Amaurose de Leder: déficit génétique en RPE65, enzyme impliquée dans la phototransduction Injection sous-rétinienne de AAV-RPE65 restauration de la vision Insuffisance cardiaque: transfert du gène codant poiur l’ATPase CERCA2A par un AAV1 infusé par voie intracoronaire HIV, influenza: injection intramusculaire d’AAV codant pour Ac spécifique Vecteurs herpes Avantages: - tropisme neurologique - capacité - non intégré mais stable Inconvénients: - difficulté de manipulation (150kb) - barrière méningée Vecteurs herpes Applications: - transfert de gène intra-cérébral - oncolyse: réplication lytique dans cellules de mélanome + transfert de GM-CSF ↘ tumeur et métastases (phase III en 2014) - thérapie génique antalgique: Neurotransmetteur inhibiteur : enképhaline/récepteur opioïd δ (phase I en 2011), endomorphine/récepteur opioïd µ Récepteur neurotransmetteur inhibiteur : récepteur de la glycine IL-10, sTNFR Vecteurs non viraux 1 - Méthodes physiques Injection d’ADN, gene gun Choc volémique Electroporation, Ultrasons Ultrasons ADN 2 - Méthodes chimiques Lipides et/ou Polymères cationiques Vecteurs non viraux 2 - Avantages: - sécurité - non immunogènicité - production à grande échelle 4 - Inconvénients: - efficacité - inflammation - durée d’expression 5 - Applications: - expression systémique Vecteur NON VIRAL RETROVIRUS ADENOVIRUS AAV Intégration ± + - ± Titre / Expression ± + +++ ++ ⊄ amitotique + Lentiviru s + + Non viral Recul Production Efficacité Stabilité Titre Efficacité Mutagénè se Immunité capacité Inflammatio n Transitoire Productio n Avantages Inconvénien ts Efiicacité Recombina nt Problème de la réponse immunitaire PROBLEME -> réponse au vecteur viral et/ou au transgène -> pré-immunisation ou immunisation induite SOLUTIONS -> délivrance locale en faible quantité -> sites à l ’ abri du système immunitaire (rétine) -> mutation du vecteur pour échapper aux Ac -> immunosuppression, induction de Treg spécifiques du transgène (IX) -> non-expression présentatrices d’Ag dans cellules - enveloppe ne ciblant pas cellules présentatrices - promoteurs spécifiques - cible pour miRNA exprimé dans cellules Restriction d’expression TransgèneCible VIH miRNA Molécule thérapeutique Cellule non hématopoïétique Cellule hématopoïétique Problème de la mutagénèse insertionnelle INTEGRATION SPECIFIQUE DE SITE LEDGF/p75 (lie intégrase) – HP1α α (lie hétérochromatine) -> intégration hors des gènes exprimés (Hum. Gene Ther. 21:337, 2010) PROMOTEURS AUTO-INACTIVES INSULATEURS SEQUENCAGE ET SELECTION DE CLONES CONCLUSION
