Transfert d`un phénotype d`un organisme à un autre

Transfert d’un phénotype
d’un organisme à un autre
Introduction
On veut introduire un plasmide
contenant la séquence d’ADN codant
pour la protéine GFP dans des bactéries
pour qu’elles acquièrent les
caractéristiques de fluorescence de la
GFP.
Extraction et modification du plasmide
Extraction du plasmide
de la bactérie
1 : ADN Génomique
Insertion des gènes codant pour la
fluorescence (GFP) et pour la
résistance à la kanamycine
2 : Plasmides
On extrait le plasmide contenant une part de l’ADN
de la bactérie. Il est utilisé comme outil génétique
car il est facilement manipulable.
On insère dans le plasmides la séquence d’ADN
codant pour la protéine GFP et celle codant pour la
résistance à la Kanamycine. La kanamycine sera
ajoutée au milieu de culture des bactéries afin de
tuer toutes celle qui n’ont pas intégré le plasmide
et ne sont donc pas résistantes à celle-ci
GFP
Gène de
résistance à la
Kanamycine
Obtention de bactéries compétentes
Ajout des plasmides
On rajoute ensuite du milieu LB puis on fait incuber
les bactéries à 37° pendant 30 minutes afin de les
laisser proliférer.
Bactéries contenant le
plasmide modifié
Bain Marie
CaCl2
Bactéries
42°
Le CaCl2 crée des pores dans la paroi
des bactéries afin d’y laisser pénétrer
les plasmides.
On crée un choc thermique pour
refermer les pores de la paroi
Etalement des bactéries
On étale les bactéries
obtenues précédemment
sur un milieu LB
contenant de la
kanamycine.
La kanamycine détruira
toutes les bactéries
n’ayant pas le plasmide
résistant à l’antibiotique
et donc pas la GFP.
Cela permet donc de ne
sélectionner que les
bactéries ayant intégré
le plasmide contenant
l’ADN qui code pour la
GFP.
Milieu LB
Bactéries
Témoin
Contenant
Ampiciline
Contenant
Kanamycine
Contenant le plasmide codant
pour la GFP et résistante à la
kanamycine.
Sans plasmide et résistante à
la kanamycine.
Contenant un plasmide non
modifié
On laisse incuber les bactéries durant la nuit.
Récupération des plasmides
Pour s’assurer de la présence des
plasmides contenant l’ADN codant pour
la GFP, on tente de les récupérer à
l’intérieur des bactéries.
On lyse les bactéries de façon à
récupérer les plasmides. Puis, après
plusieurs réactions enzymatiques, on
récupère la section du plasmide codant
pour la GFP.
Action des
enzymes…
… qui isolent la
section d’ADN codant
pour la GFP.
Afin de vérifier que la section d’ADN récupérée est bien celle codant pour la
GFP, on coule ensuite un gel d’agarose dans lequel on compare la migration des
plasmides avec celle d’un marqueur sous une lampe UV.
Bande
correspon
dante au
plasmide
Marqueur
Bande
correspon
dante à la
section
codant
pour la
GFP
Réalisé par :
- HELICK Julien
-TANI Emilie
- GRARD Jérôme
- BOTZANOWSKI Thomas
- CERAULO Hugo