Chapitre 2.7.7.
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CHAPITRE 2.7.7. RYNGOTRACHÉITE INFECTIEUSE AVIAIRE RÉSUMÉ La laryngotrachéite infectieuse aviaire (LTI) est une maladie respiratoire due à un Herpesviridae, Alphaherpesvirinae, Gallid herpesvirus 1. Il s’agit principalement d’une maladie de la poule bien que le faisan, la perdrix et le paon soient aussi affectés. Les symptômes et les lésions peuvent varier d’une atteinte très sévère où certains oiseaux meurent d’asphyxie, à une forme très atténuée difficile à différencier d’une autre maladie respiratoire bénigne chez des poulets. La lésion principale est une trachéite. Le diagnostic au laboratoire correspond à l’isolement du virus, à la mise en évidence du virus ou de l’antigène viral et de la détection des anticorps spécifiques dans le sérum. L’observation d’inclusions intranucléaires dans la trachée lors d’un examen histopathologique permet également le diagnostic. Identification de l’agent pathogène : l’isolement du virus doit être effectué par l’inoculation du matériel suspect sur la membrane chorioallantoïdienne d’œufs embryonnés ou sur cultures cellulaires issues d’embryon de poulet. Ces méthodes demandent du temps mais sont sensibles. Les méthodes rapides sont l’examen direct en microscopie électronique d’un exsudat trachéal, une immunofluorescence sur exsudat trachéal ou coupes congelées de trachée, l’immunodiffusion en gélose (IDG) pour détecter les antigènes viraux sur des prélèvements de trachée ou sur du matériel venant d’un œuf infecté, et la méthode immuno-enzymatique (ELISA) pour détecter l’antigène viral dans les raclements de la muqueuse trachéale. Il a été observé que les techniques moléculaires utilisant l’amplification en chaîne par polymérase (PCR) sont plus sensibles que l’isolement du virus pour l’examen des prélèvements. Ces techniques devraient être ainsi plus souvent utilisées dans le futur. L’isolement du virus peut se révéler nécessaire si ces tests son négatifs ou douteux. Épreuves sérologiques : les anticorps dirigés contre le virus LTI peuvent être détectés par les tests de séroneutralisation réalisés sur œufs ou cultures cellulaires, ou par des réactions d’IDG, d’immunofluorescence indirecte, ou ELISA. Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique : les vaccins contre la LTI sont habituellement préparés à partir de virus vivant atténué. Les vaccins commercialisés procurent un certain degré de protection, mais ne sont pas complètement satisfaisants. A. INTRODUCTION La laryngotrachéite infectieuse aviaire (LTI) est une maladie respiratoire de la poule due à un Alphaherpesvirus. Elle peut aussi affecter le faisan, la perdrix et le paon. Dans sa forme virulente, cette maladie est caractérisée par son historique, les symptômes et des lésions trachéales très sévères alors que la forme atténuée est difficile à différencier des autres maladies respiratoires bénignes. Le diagnostic au laboratoire dépend de la mise en évidence du virus ou de l’antigène viral ou encore des anticorps sériques spécifiques (14). Cliniquement, la maladie peut apparaître sous 3 formes, dénommées suraiguë, subaiguë et chronique ou bénigne. Dans la forme suraiguë, la maladie apparaît soudainement et se propage rapidement. Le taux de morbidité est élevé et le taux de mortalité peut dépasser 50 %. Quelques oiseaux peuvent mourir subitement (avec un aspect de bonne condition physique) avant l’apparition des signes cliniques caractéristiques comprenant des difficultés respiratoires avec le cou restant tendu et de la suffocation lors des tentatives d’inspiration. On observe aussi des gargouillements, des râles et de la toux lorsque les oiseaux essaient d’expulser le matériel obstruant la trachée. Des caillots sanguins peuvent être ainsi expulsés et retrouvés sur le sol ou les murs du bâtiment. Les lésions sont limitées au tractus respiratoire supérieur et elles sont aussi caractéristiques, consistant en une trachéite hémorragique avec des caillots sanguins, une rhinite mucoïde et du mucus teinté de sang le long de la trachée. 982 Manuel terrestre de l’OIE 2005 Chapitre 2.7.7. — Laryngotrachéite infectieuse aviaire Dans la forme subaiguë, le début de la maladie est plus lent et les symptômes respiratoires peuvent évoluer sur quelques jours avant l’observation d’une mortalité. Le taux de morbidité est élevé, mais celui de la mortalité est plus faible que dans la forme subaiguë, entre 10 % et 30 %. Les lésions sont moins sévères et correspondent à un exsudat mucoïde avec ou sans présence de sang dans la trachée. On peut observer des membranes diphtéroïdes caséeuses jaunâtres adhérentes au larynx et à la muqueuse trachéale en partie supérieure. La LTI chronique ou bénigne peut être observée chez les oiseaux survivants de l’une des formes précédentes de la maladie, bien que quelques foyers puissent apparaître d’emblée uniquement bénins. L’incidence de la LTI chronique dans un élevage peut n’être que de 1 à 2 %, avec la plupart des oiseaux mourant de suffocation. Les symptômes comprennent des accès de toux et des difficultés respiratoires, avec des écoulements par le nez et la bouche, et une diminution de la production des œufs. Les lésions observées sont localisées à la trachée, le larynx et la cavité buccale, avec la présence de dépôts nécrotiques caséeux et diphtéroïdes en plaques ou en amas. La survenue d’une LTI bénigne peut atteindre un grand nombre d’oiseaux simultanément avec pour seules lésions majeures une conjonctivite, une sinusite et une trachéite mucoïde. Etant donné que la transmission de la LTI s’effectue par contact étroit, la transmission est plus lente dans les cages que dans les élevages en liberté et la progression de l’infection dans un bâtiment avec cages peut être évidente. B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC 1. Identification de l’agent pathogène Le virus peut être isolé sur cultures de cellules de foie (13) ou de rein (6) d’embryon de poulet ou encore de reins de poulet (18). Parmi celles-ci les cultures de cellules embryonnaires hépatiques sont les plus sensibles (8). Le virus peut aussi être cultivé par passage sur la membrane chorioallantoïdienne (MCA) d’embryons de poulet exempts d’agents pathogènes spécifiques (EAPS) âgés de 10 à 12 jours (9). Le virus causal peut être mis en évidence directement dans un exsudat trachéal par microscopie électronique (18). Les antigènes viraux peuvent être détectés par immunofluorescence (4, 19), immunodiffusion en gélose (IDG) (10), ou une méthode immuno-enzymatique (ELISA), sur des raclements de la muqueuse trachéale (21). L’examen histopathologique de la trachée avec l’observation des inclusions intranucléaires caractéristiques des herpèsviroses peut être aussi utile (3, 15). Les méthodes utilisant l’amplification en chaîne par polymérase (PCR) pour détecter le virus LTI ont été décrites, la PCR étant considérée généralement plus sensible que l’isolement du virus (2, 11, 12, 20). a) Isolement du virus Lorsque les prélèvements sont effectués sur des oiseaux vivants pour l’isolement viral, les écouvillons trachéaux sont préférables aux écouvillons oropharyngés ou conjonctivaux. Ils doivent être placés dans un milieu de transport additionné d’antibiotiques. Lorsque la maladie est chronique, le choix des prélèvements pour l’isolement du virus doit être effectué sur un animal euthanasié au début des signes cliniques plutôt que de tenter cet isolement chez un oiseau mort à la suite d’une asphyxie après une longue évolution. La qualité du prélèvement est meilleure si l’oiseau est tué par injection de barbituriques ou autres produits plutôt que par dislocation cervicale. Il faut prélever la tête entière et le cou des animaux morts ou seulement la trachée et le larynx après leur prélèvement en évitant au maximum toute contamination. Les trachées doivent être transportées dans un milieu additionné d’antibiotiques, mais emballées dans un papier humide si elles sont destinées à la microscopie électronique. Tout stockage prolongé des tissus infectés doit être réalisé à –70°C ou moins pour limiter une perte du titre viral. Il faut éviter les congélations et décongélations répétées qui diminuent l’infectiosité du virus. L’exsudat et les cellules épithéliales raclés de la trachée sont dilués au 1/5 dans un milieu nutritif contenant de la pénicilline et de la streptomycine, le mélange étant agité vigoureusement. La suspension obtenue est centrifugée à faible vitesse pour enlever les débris, puis 0,1 ml du liquide surnageant est inoculé sur la MCA d’au moins 3 œufs embryonnés de poulet âgés de 10 à 12 jours. Les œufs sont obturés avec de la paraffine et mis à incuber à 37°C pendant plus de 7 jours. Ils sont mirés tous les jours puis l’on recherche les foyers nécrotiques typiques sur les MCA des embryons morts ou survivants au-delà de 7 jours. Alternativement, on peut utiliser des cultures cellulaires de foie ou de rein d’embryon de poulet. Lorsque le tapis cellulaire est complet, le milieu est éliminé puis les cellules sont inoculées et mises en contact pour adsorber le virus pendant 1 à 2 h. Puis les cultures sont recouvertes d’un nouveau milieu et mises en incubation jusqu’à 7 jours en étant examinées tous les jours au microscope dans le but de mettre en évidence un effet cytopathogène (ECP) caractérisé par l’apparition de cellules syncytiales. Dans chaque cas, 3 passages de matériel biologique au moins sont nécessaires avant de considérer qu’un prélèvement est négatif. L’isolement d’un virus LTI peut être confirmé par un test de séroneutralisation (SN) sur œufs ou sur culture cellulaire en utilisant un antisérum LTI hyperimmun. Alternativement, des particules Manuel terrestre de l’OIE 2005 983 Chapitre 2.7.7. — Laryngotrachéite infectieuse aviaire virales peuvent être identifiées rapidement dans le liquide de cultures cellulaires ou sur les foyers nécrotiques des MCAs par microscopie électronique et l’antigène viral peut être détecté par immunofluorescence sur des cultures cellulaires infectées fixées avec de l’acétone ou sur des coupes congelées de MCA. b) Microscopie électronique Le virus peut être mis en évidence par microscopie électronique à partir d’un raclage de trachée ou d’un exsudat trachéal étalé et mélangé avec quelques gouttes d’eau distillée sur une lame pour microscopie. Une goutte de cette suspension est placée sur un carbone et une grille porte-objet préalablement enduite d’un film continu de formvar, laissée pendant 2 min puis l’excès de liquide est retiré avec du papier filtre. Une goutte d’acide phosphotungstique à 4 % de pH 6,4 est ajoutée puis, après 3 min, l’excès de liquide est éliminé. La grille est séchée minutieusement puis examinée au microscope électronique à un grossissement de × 30 à 45 000 pour les particules caractéristiques des herpesvirus. c) Immunofluorescence Pour les épreuves d’immunofluorescence pour les antigènes viraux, les cellules épithéliales obtenues par raclage de trachée sont étalées sur une lame de verre. Alternativement des coupes de trachée d’une épaisseur de 5 µm obtenues par congélation rapide sont fixées dans l’acétone à la température du laboratoire pendant 10 min. Ces prélèvements peuvent être colorés directement en utilisant des immunoglobulines anti-virus LTI marquées par de l’isothiocyanate de fluorescéine (ITCF) appliquées pendant 1 h, suivi d’un rinçage pendant 15 min dans un bain d’une solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS) à pH 7,2, sous agitation magnétique. Sinon, ils peuvent être colorés indirectement en utilisant un sérum de poulet anti-LTI de dilution appropriée appliqué pendant 1 h. La lame est rincée minutieusement avec du PBS pendant 15 min comme ci-dessus et les immunoglobulines anti-virus LTI marquées par de l’ICTF sont appliquées pendant 30 min. Après un dernier rinçage, la préparation est recouverte d’une lamelle avec un milieu de montage non coloré. Les préparations sont examinées à l’aide d’un microscope à fluorescence sous lumière ultra-violette pour rechercher une fluorescence spécifique intranucléaire dans les cellules épithéliales. Des témoins appropriés sont effectués en utilisant du matériel de référence non infecté et, pour les méthodes indirectes, du sérum de poulet négatif. Des précautions particulières doivent être prises lors de la lecture des préparations pour l’immunofluorescence car des IgG endogènes de poulet dans la trachée peuvent provoquer une fixation non souhaitée des immunoglobulines anti-virus LTI marquées par de l’ICTF. d) Immunodiffusion en gélose Les antigènes du virus LTI peuvent être mis en évidence sur un exsudat trachéal, les MCAs infectées et des cultures cellulaires infectées en utilisant de l’antisérum hyperimmun LTI. La gélose est préparée avec de la gélose Noble agar (1,5 %) contenant du chlorure de sodium (8 %) et de l’azide de sodium (0,02 %) – en tant que conservateur – dans de l’eau distillée. Les ingrédients sont autoclavés à 2,4 bar (15 lb/sq. inch) pendant 15 min; 5 ml de la gélose liquide sont versés dans une boîte de Petri de 5 cm de diamètre. Quand la gélose est figée, une série de puits sont réalisés dans la gélose. Les puits ont habituellement 8 mm de diamètre et 4 mm d’intervalle. Le sérum hyperimmun est placé avec une pipette dans le puits central alors que les puits qui l’entourent sont remplis avec les prélèvements suspects d’être virulents à tester, à l’exception d’un puits témoin positif contenant l’antigène viral. Les disques sont ensuite mis en incubation en atmosphère humide à la température du laboratoire ou à 37°C, puis examinés 24 à 48 h plus tard en lumière oblique pour identifier les lignes de précipitation. Les tests doivent aussi comporter un témoin antigène négatif avec du matériel non infecté et un antisérum témoin négatif. Pour des raisons économiques, ce test peut être réalisé sur une lame de microscope recouverte d’une fine couche de gélose où les trous ont 4 mm de diamètre et 2 mm d’intervalle. e) Méthode immuno-enzymatique La méthode ELISA utilisant les anticorps monoclonaux (AcM) peut être employée pour mettre en évidence les antigènes viraux (16). L’exsudat trachéal est mélangé avec un même volume de PBS contenant 1 % (v/v) de détergent comme le Nonidet P40 (BDH Chemicals, Poole, Royaume-Uni), puis mixé pendant 30 secondes et centrifugé à 10 g pendant 1 min. Le liquide surnageant est distribué sous un volume de 50 µl dans les cupules des microplaques préalablement recouvertes d’IgG de lapin anti-virus LTI diluées au 1/200 dans 0,05 M de tampon carbonate/bicarbonate, de pH 9,0 ; et mis en incubation pendant 1 h. Puis 50 µl d’AcM dirigés contre les principales glycoprotéines du virus LTI, dilués au 1/50 dans du PBS, sont ajoutés dans chaque cupule, suivis par 50 µl d’une dilution au 1/1 000 d’IgG anti-souris purifiée d’origine caprine conjuguée à de la peroxydase de raifort. Le substrat, l’acide 5-aminosalicylique (6,5 mM), est ajouté dans les cupules au volume de 100 µl. Après 30 min, les plaques sont lues à l’aide d’un spectrophotomètre à 450 nm et la lecture de l’absorbance pour chaque cupule est corrigée par la soustraction de la lecture obtenue avec 984 Manuel terrestre de l’OIE 2005 Chapitre 2.7.7. — Laryngotrachéite infectieuse aviaire les cupules témoins contenant du tampon dilué au lieu de l’exsudat trachéal. La limite positif/négatif est déterminée par la valeur moyenne de l’absorbance obtenue avec plusieurs prélèvements négatifs (matériel trachéal sans virus LTI) plus 3 écart-types. f) Histopathologie Les trachées destinées à un examen histologique doivent être placées dès leur prélèvement sur les oiseaux dans une solution de formol et incluses dans des blocs de paraffine. Des inclusions Intranucléaires peuvent être observées dans les cellules de l’épithélium trachéal sur des coupes longitudinales colorées par l’hématoxyline et l’éosine. Il s’agit des inclusions classiques de type A de Cowdry des herpesviroses, mais elles peuvent n’être présentes que pendant les 3 à 5 jours suivant l’infection. Dans les cas sévères où la plupart des cellules infectées se sont détachées de la trachée, les inclusions seront visibles sur les cellules intactes dans les débris cellulaires présents dans la lumière trachéale. g) Méthodes moléculaires Des méthodes moléculaires pour identifier l’ADN du virus LTI dans les prélèvements ont été rapportées (11, 12, 20). Un test d’hybridation Dot Blot avec des fragments ADN de virus cloné s’est révélé très sensible pour la détection du virus alors que l’ELISA était négatif (11, 12). La PCR s’est révélée plus sensible que l’isolement viral dans les prélèvements, en particulier lorsque d’autres contaminants viraux comme les adénovirus sont présents (20). Alexander et Nagy (2) ont montré que la PCR et l’isolement viral présentent la même sensibilité du milieu de la phase d’infection jusqu’à la fin de celle-ci, alors que la PCR se révèle supérieure pendant la phase de guérison. Jusqu’à présent, le problème des méthodes de détection du virus LTI était la difficulté de pouvoir différencier les souches du terrain des souches vaccinales. Ce problème pourrait être résolu avec les travaux de Chang et al. (5), qui utilisent la PCR conjointement avec la PCR-RFLP (PCR-Polymorphisme de longueur des fragments de restriction). Cette approche permettrait aussi de mieux comprendre l’épidémiologie et l’évolution du virus LTI. En effet, l’analyse des souches coréennes du virus LTI par la PCR-RFLP, qui permet de classer les virus en fonction de la thymidine kinase et des gènes des glycoprotéines, montre que la méthode peut être utilisée pour distinguer les souches de faible et de forte virulences (7). 2. Épreuves sérologiques Les anticorps dirigés contre le virus LTI dans le sérum du poulet peuvent être détectés par SN, IDG, immunofluorescence indirecte et ELISA (1). a) Séroneutralisation Les tests de SN sont réalisés sur des MCAs d’œufs embryonnés de poulets âgés de 9 à 11 jours, où les anticorps spécifiques doivent neutraliser la formation des foyers nécrotiques dus au virus LTI. Ces tests peuvent également être effectués de manière alternative sur des cultures cellulaires où les anticorps spécifiques neutralisent le virus LTI en prévenant l’ECP. Des dilutions de sérums de raison 2 sont ajoutées à un volume égal d’une solution virale à concentration constante. Cette concentration peut être équivalente soit à 100 DIE50 (Dose de virus infectant 50 % des embryons), soit à 100 DICT50 (Dose de virus infectant 50 % de la culture tissulaire). Ces mélanges sont mis en incubation à 37°C pendant 1 h pour permettre la neutralisation virale. Lorsque le test est réalisé sur des œufs, les mélanges virus/sérum sont inoculés par la voie chorioallantoïdienne, avec l’emploi d’au moins 5 œufs par dilution. Les œufs sont obturés puis incubés à 37°C pendant 6 à 7 jours. Le point limite est enregistré à la plus forte dilution du sérum où l’on n’observe pas de foyers nécrotiques sur les MCAs. Quand les tests sont pratiqués sur des cultures cellulaires, les dilutions de sérums sont préparées dans des microplaques à 96 cupules, puis le virus est ajouté. Après la période nécessaire pour la neutralisation, des cellules fraîches de foie ou de rein d’embryon de poulet sont ajoutées dans chaque cupule. Les plaques sont mises en incubation à 37°C dans une atmosphère à 5 % de CO2 et examinées tous les jours pour un ECP ; le point limite à 50 % est lu après environ 4 jours quand le « témoin virus » indique que 30-300 DICT50 ont été utilisées dans ce test. Pour le test utilisant la culture cellulaire, une neutralisation du virus au 1/8 (dilution initiale) ou plus est considérée comme positive. b) Immunodiffusion en gélose Pour les tests d’IDG, l’antigène est préparé à partir des MCAs infectées par le virus où des cultures cellulaires infectées. Dans le premier cas, au moins 104 DICT50 du virus LTI sont inoculées dans la cavité allantoïdienne d’un groupe d’œufs embryonnés EAPS âgés de 10 jours. Les MCAs sont récoltées après 4 jours d’incubation et celles qui présentent de larges foyers nécrotiques sont homogénéisées puis Manuel terrestre de l’OIE 2005 985 Chapitre 2.7.7. — Laryngotrachéite infectieuse aviaire soniquées dans un faible volume de PBS à pH 7,1. Dans l’autre cas, des cultures cellulaires de foie ou de rein d’embryon de poulet ou de cellules rénales de poulet, fortement infectées, sont mises en incubation à 37°C jusqu’à l’obtention d’un ECP maximal. Toutes les cellules encore attachées sont grattées et récoltées dans le milieu de culture. La récolte des cultures peut être concentrée jusqu’à 100 fois par dialyse contre du polyéthylène glycol (PEG 20 000 ou PEG 30 000). Pour le test la gélose est préparée comme décrit ci-dessus pour la détection de l’antigène, mais dans ce cas c’est l’antigène de la MCA ou de la culture cellulaire qui est placé dans le puits central et les sérums à tester dans les puits périphériques. Des antisérums témoins positif et négatif sont utilisés dans ce test qui est lu après 24 à 48 h d’incubation à la température du laboratoire ou à 37°C. Les tests d’IDG sont simples, économiques et utiles pour un dépistage de la LTI dans l’élevage mais sont moins sensibles que les autres méthodes. c) Épreuve d’immunofluorescence indirecte Pour les épreuves d’immunofluorescence indirecte, l’antigène est préparé sur plusieurs microcultures cellulaires infectées par le virus LTI et multipliées sur des lames multispot recouvertes de téflon. Quand l’ECP apparaît, les cultures sont fixées dans l’acétone pendant 10 min. Les dilutions du sérum à tester sont préparées dans du PBS et appliquées sur chaque microculture, les lames étant mises par la suite en incubation pendant 1 h à 37°C. Les lames sont rincées avec du PBS comme décrit ci-dessus, égouttées puis traitées avec une dilution appropriée d’une solution commerciale d’IgG anti-poulet préparée sur lapin et marquée par l’ICTF. Après 1 h d’incubation à 37°C, les lames sont lavées de nouveau et des lamelles sont montées avec un milieu de montage non coloré. Elles sont examinées par épifluorescence à la lumière ultraviolette et le titre du point limite est donné par la lecture de la plus forte dilution du sérum montrant une fluorescence spécifique. Cette épreuve est plus sensible que l’IDG mais l’interprétation des résultats peut être subjective. d) Méthode immuno-enzymatique L’antigène pour le test ELISA est obtenu par sonication de cultures cellulaires fortement infectées et récoltées au moment où l’ECP est maximal, et il est ensuite adsorbé sur les cupules des microplaques. L’antigène témoin négatif est obtenu à partir de cultures cellulaires non infectées traitées selon la même technique. Le test consiste essentiellement à ajouter 0,1 ml de dilutions progressives au 1/10 du sérum à tester dans les cupules sensibilisées par l’antigène positif ou négatif. Après une incubation à 37°C pendant 2 h, les plaques sont lavées 4 fois et un sérum anti-poulet préparé sur lapin et conjugué à une peroxydase est ajouté à la dilution 1/4 000. Après une incubation à 37°C pendant 1 h, les plaques sont de nouveau lavées 4 fois. Finalement un substrat contenant de l’acide 5-aminosalicylique est ajouté dans chaque cupule, suivi d’une solution de peroxyde d’hydrogène à la concentration finale de 0,0005 %, et l’absorbance du liquide de chaque cupule est lue au spectrophotomètre à 450 nm. Le résultat de chaque sérum est exprimé par la différence entre l’absorbance moyenne produite entre les antigènes positifs et négatifs. Le seuil limite positif/négatif est donné par la valeur moyenne de l’absorbance des sérums négatifs plus 3 écart-types. Le test est très sensible et il est possible qu’il s’agisse du meilleur test pour surveiller les élevages. Une trousse de diagnostic ELISA pour la recherche des anticorps dirigés contre la laryngotrachéite de la poule est disponible dans le commerce. C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS ET AUX PRODUITS BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE La LTI est habituellement contrôlée à l’aide de vaccins à virus vivants bien que des vaccins à virus inactivés aient été aussi utilisés pour des raisons de sécurité. La souche de semence du virus vivant est une souche du virus LTI suffisamment atténuée ou une souche naturellement avirulente. Les vaccins peuvent être administrés par instillation oculaire, aérosol ou dans l’eau de boisson. Lors d’une administration par aérosol, on peut provoquer la maladie en utilisant des tailles très petites pour les gouttes produites qui seront alors inhalées. Les jeunes poulets doivent être vaccinés dans les régions enzootiques, mais ils montrent souvent des réactions post-vaccinales plus sévères. Des doses répétées sont nécessaires pour obtenir une bonne protection. Le taux de virulence du virus vaccinal est critique. Les souches de faible virulence peuvent ne pas être efficaces et celles de plus grande virulence peuvent provoquer une maladie grave. L’administration du vaccin par aérosol nécessite d’être prudent sur la taille des gouttes dispersées et l’uniformité de l’application. Elle peut être plus efficace avec les souches de faible virulence mais peut devenir dangereuse avec des souches très virulentes. Actuellement les vaccins disponibles tentent de faire un compromis entre le manque d’efficacité et une innocuité réduite. En raison de la persistance d’un virus vaccinal virulent sur le terrain, il peut être difficile d’arrêter la vaccination une fois qu’elle est commencée. Des infections croisées dues au virus vaccinal et au virus du terrain chez les oiseaux vaccinés peuvent provoquer, chez les oiseaux non vaccinés en contact avec ces derniers, une maladie grave. Des recommandations pour la production des vaccins vétérinaires sont fournies dans le Chapitre I.1.7., « Principes de fabrication des vaccins à usage vétérinaire ». Les recommandations fournies ici et dans le Chapitre I.1.7. sont souhaités générales par nature et peuvent être complétées par des recommandations nationales ou régionales (par ex. réf. 17). 986 Manuel terrestre de l’OIE 2005 Chapitre 2.7.7. — Laryngotrachéite infectieuse aviaire 1. Gestion des semences virales a) Caractéristiques de la semence virale Le lot de semence primaire (MSV) est sélectionné et peut être cultivé sur des œufs embryonnés de poulets EAPS ou des cultures cellulaires provenant de ces mêmes embryons. Le MSV est testée sur des embryons de poulet ou des poulets pour les critères suivants : 1) pureté, 2) Mycoplasma spp., 3) Salmonella spp., 4) virus de la leucose aviaire, 5) virus hémagglutinants, 6) identification du virus, et 7) agents pathogènes extérieurs. De plus des tests initiaux sont réalisés pour démontrer l’innocuité et l’efficacité de la souche de semence choisie. Le test d’innocuité pour le MSV doit inclure des tests montrant l’absence de réversion de la virulence après plusieurs passages en série et aussi son innocuité chez les oiseaux. On vérifie aussi l’évidence d’une excrétion et d’une propagation. Le MSV est conservée dans des aliquots à –70°C. Le MSV ne doit pas causer de mortalité ou une réaction respiratoire sévère chez les poulets après instillation oculaire. Les faisans sont quant à eux plus sensibles. L’administration par aérosol est pratique mais peut provoquer une maladie respiratoire sévère dans certains élevages. b) Méthodes de culture Pour la production en grande quantité de vaccins, le virus est multiplié sur des embryons de poulet EAPS ou des cultures cellulaires dérivées de ces mêmes embryons, jusqu’au 5e passage à partir du MSV. Le niveau de passage acceptable est déterminé expérimentalement par le niveau de passage utilisé pour préparer le produit expérimentalement dans l’étude d’efficacité. c) Validation de la semence candidate comme semence vaccinale Un test doit être réalisé pour démontrer l’efficacité du vaccin chez les oiseaux à l’âge minimal requis pour lequel le vaccin est indiqué et aussi pour différentes espèces aviaires. Ceci est répété plus tard pour les lots de poulets pour chaque voie d’administration et/ou l’âge des oiseaux recommandés. Trois semaines plus tard (ou 10 à 14 jours aux Etats-Unis), les oiseaux, réunis avec dix témoins du même âge et de même origine, sont éprouvés par la voie intratrachéale ou dans le sinus orbitaire avec une souche de virus LTI de forte virulence connue. Le test est satisfaisant si seulement 5 % des oiseaux vaccinés meurent ou présentent des signes sévères de LTI. Il ne doit y en avoir plus de quatre présentant des signes modérés de LTI. Au moins huit témoins doivent mourir ou présenter des symptômes graves de LTI. 2. Méthode de fabrication Le vaccin est produit par inoculation de la souche virale de production chez des embryons de poulet âgés de 9 à 11 jours ou de cultures cellulaires préparées à partir d’embryons de poulet provenant d’élevages EAPS. Les œufs sont inoculés par un trou dans la coquille, sur la MCA. Ceux-ci sont ensuite obturés et mis en incubation à 37°C pendant 4 à 6 jours. Tous les œufs sont mirés avant la récolte et seuls ceux qui ont des embryons vivants sont utilisés. Pour récolter le virus, les œufs sont refroidis puis nettoyés et ouverts de manière aseptique. Les MCAs et les liquides sont récoltés dans des récipients réfrigérés. Les MCAs doivent présenter les foyers de nécrose épais et grisâtres caractéristiques du virus LTI. Les produits dérivés des cultures cellulaires doivent être préparés à partir des liquides contenant ces cultures cellulaires, qui seront ensuite mélangés et testés. 3. Contrôles en cours de fabrication Les homogénats de tissus infectés ou de cultures cellulaires doivent être testés pour leur pureté, leur activité et leur titre en virus puis mixés avec un stabilisant (habituellement de la peptone de bœuf et du saccharose) puis lyophilisés et conservés à 4°C. 4. Contrôle des lots a) Stérilité Les tests de stérilité et l’absence de contamination du matériel biologique se trouvent dans le Chapitre I.1.5., « Contrôle de la stérilité ou de l’absence de contamination des matériels biologiques ». b) Innocuité En utilisant la voie d’administration recommandée, chaque lot de vaccin doit être testé chez 10 poulets EAPS ou 10 oiseaux des autres espèces cibles, en utilisant 10 doses par oiseau. Les oiseaux sont observés pendant au moins 21 jours pour observer des effets indésirables pouvant être attribués au vaccin. c) Activité Une fois que l’efficacité du vaccin in vivo a été établie, l’activité du lot peut être déterminée par la mesure du titre en virus. Des dilutions en série du vaccin sont inoculées sur la MCA d’embryons de poulet EAPS âgés Manuel terrestre de l’OIE 2005 987 Chapitre 2.7.7. — Laryngotrachéite infectieuse aviaire de 9 à 11 jours, en utilisant au moins 7 œufs par dilution, dans un volume de 100 µl. Les œufs sont mis en incubation pendant 5 jours et le titre en virus est calculé par l’observation des lésions caractéristiques sur les MCAs. Le contenu viral doit être supérieur ou égal à la valeur annoncée lors de la fabrication et supérieur au titre prévu en fin d’expiration du produit. Tous les titres à la production et à l’expiration sont basés sur la dose minimale protectrice décrite ci-dessus. d) Durée de l’immunité Les résultats de la vaccination dépendront de nombreux facteurs, dont le programme des doses vaccinales et la voie d’administration. Un certain degré de protection vis-à-vis de la LTI devrait être induit sur une période de plusieurs mois. e) Stabilité La stabilité est testée en prenant des prélèvements du vaccin stocké à divers intervalles et par la mesure du titre en virus. Les tests devront être réalisés sur au moins 6 lots vaccinaux ou jusqu’à ce qu’un nombre statistiquement valide de séries ait été évalué et ait continué durant 3 mois après la demi-vie annoncée. f) Agents de conservation Les agents de conservation ne sont pas obligatoires mais quelques antibiotiques peuvent être ajoutés à la récolte des tissus ou pendant la production en série. Pour les produits sous licence aux Etats-Unis d’Amérique, tout antibiotique ajouté doit être signalé sur l’étiquette. g) Précautions et mise en garde Des précautions doivent être prises lors de la dilution et l’administration du vaccin et lors de l’élimination du vaccin non utilisé. 5. Contrôles du produit fini a) Innocuité Aux Etats-Unis d’Amérique, 25 poulets sensibles sont inoculés par la voie intratrachéale et observés pendant 14 jours. Les morts sont comptabilisées en tant qu’échec. Un contrôle avec quatre échecs ou moins est considéré comme satisfaisant pour les séries. Dans l’Union Européenne, les tests sur le titre viral sont réalisés. Les titres en virus doivent normalement ne pas dépasser le 1/10e de la dose considérée comme sans risque. b) Activité Le test sur le titre viral (voir plus haut) peut être aussi utilisé en tant que mesure d’activité. Ce titre ne doit pas être inférieur au titre minimal agréé. Chaque série ou sous-série doivent présenter un titre en virus de 107 supérieur à la dose minimale protectrice mais pas moins de 1025 DIE50 (ou DICT50 pour les produits préparés sur cultures cellulaires)/dose. c) Tests sur le produit fini L’absence d’agents pathogènes pour le poulet doit être confirmée sur les embryons ou des poulets. Elle doit être aussi confirmée par la recherche de Mycoplasma spp., Salmonella spp., du virus de la leucose aviaire et des virus hémagglutinants. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. ADAIR B.M., TODD D., MCKILLOP E.R. & BURNS K. (1985). Comparison of serological tests for the detection of antibodies to infectious laryngotracheitis virus. Avian Pathol., 14, 461–469. 2. ALEXANDER H.S. & NAGY E. (1997). Polymerase chain reaction to detect infectious laryngotracheitis virus in conjunctival swabs from experimentally infected chickens. Avian Dis., 41, 646–653. 3. ARMSTRONG W.H. (1959). A slide smear technique for the diagnosis of laryngotracheitis. Avian Dis., 3, 80–84. 4. BRAUNE M.O. & GENTRY R.F. (1985). Standardization of the fluorescent antibody technique for the detection of avian respiratory viruses. Avian Dis., 9, 535–545. 988 Manuel terrestre de l’OIE 2005 Chapitre 2.7.7. — Laryngotrachéite infectieuse aviaire 5. CHANG P.C., LEE Y.L., SHIEN J.H. & SHIEH H. K. (1997). 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