ADN et Génétique
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Présentation ADN Fishbase Jolien Bamps Les lois de Mendel et la transmission de l’hérédité Gregor Mendel Moine et botaniste hongrois (1822- 1884), en charge de maintenir le potager de son monastère Considéré comme le « fondateur » de la génétique Ses expériences lui permirent de tirer des conclusions sur la transmission héréditaire des caractères et de certains « facteurs » au fil des générations : il est à l’origine des lois de Mendel Modèle expérimental Il va travailler sur des lignées de petits pois (Pisum sativum) : Autofécondation Caractères visibles à l’œil nu : forme du pois, couleurs des fleurs,… Il peut avoir accès à des souches pures dont tous les descendants exprimeront un caractère unique Les lois de Mendel 1ère loi : Loi d’uniformité des caractères à la première génération Croisement de deux lignées de pois de race pure (pois à graines lisses et pois à graines ridées) et observation de la forme des graines chez les descendants Lors de la première génération F1, tous les pois ont un aspect lisse. Le caractère « ridé » n’apparaît pas chez les descendants et semble avoir complètement disparu Les lois de Mendel 2ème loi : Ségrégation des caractères Croisement entre individus obtenus à la génération F1 dont les graines ont un aspect lisse Apparition du caractère ridé chez les individus de la génération F2 Le caractère ridé est porté par les individus de la génération F1 mais ne s’exprime pas La notion de dominant et récessif est introduite. Le caractère lisse est dit dominant et le ridé récessif, car il ne se manifeste pas à la génération F1 Les lois de Mendel 3ème loi : Loi d’indépendance Quand les parents différent par plusieurs caractères, par exemple ici la forme (lisse ou ridée) ou la couleur de la graine (vert ou jaune), les caractères se transmettent de façon indépendante les uns des autres: Les hybrides de la génération F1 présentent le trait dominant pour chacun des caractères (ici, jaune et lisse) Lors des générations suivantes, les . descendants vont présenter toutes les combinaisons possibles La transmission de l’hérédité Mendel ne parlait pas de « gènes » mais de transmission de certains « facteurs » au fil des générations En 1900, trois botanistes, De Vries, Correns et Von Tschermak, réalisèrent des expériences identiques à celles de Mendel chez d’autres végétaux et obtenèrent des résultats identiques Le mot gène est créé pour définir le « facteur » supposé par Mendel mais aucune aucune indication ne laissait penser que les gènes étaient liés aux chromosomes…. La transmission de l’hérédité Les lois de Mendel tombèrent dans l’oubli pendant 35 ans jusqu’à ce que Morgan démontre que la couleur des yeux des drosophiles se transmettait de façon différente chez les mâles et les femelles Morgan élabore une théorie de l’hérédité liée au sexe selon laquelle le gène responsable de la couleur des yeux chez la drosophile serait localisé sur le chromosome x Il en déduit que l’information génétique est portée par les chromosomes Les chromosomes, le support de l’hérédité Les chromosomes Chez les cellules eucaryotes, les chromosomes sont entourés d’une membrane, le noyau, qui les sépare du reste de la cellule. Cette membrane est absente chez les procaryotes (bactéries) Les cellules eucaryotes comportent généralement plusieurs chromosomes Les chromosomes Chez l’humain, il y a 2 copies de chaque chromosome (1 qui provient de la mère et 1 qui provient du père) et il y a 23 paires de chromosomes Les chromosomes Chaque chromosome contient une chaîne extrêmement longue d’acide désoxyribonucléique (ADN) qui est fortement empaquetée Suite aux expériences de Griffith sur des souches de pneumocoques, il en a été déduit que l’information génétique réside dans l’ADN et dans la succession de ces bases azotées L'acide désoxyribonucléique (ADN) L’ADN L’ADN est composé de 4 bases azotées : Adénine Purines Guanine Thymine Pyrimidines Cytosine Les bases azotées sont complémentaires deux à deux, une base purique s'associant toujours à une base pyrimidique L’information génétique va résider dans la succession de ces bases On pourrait comparer l’ADN a un texte écrit dans un alphabet de 4 lettres L’ADN In 1953, Watson & Crick ont proposé un modèle pour la structure de l’ADN : la double hélice L’ADN La double hélice est composée de deux brins complémentaires qui sont formés par un assemblage de sucre (désoxyribose) unis par des groupements phosphates Les bases (A, T, G, C) sont liées aux groupements phosphate et forment les barreaux d’une échelle imaginaire dans laquelle A est toujours en face de T et G en face de C Les deux brins sont unis grâce à des liaisons hydrogène Le but de l’ADN https://www.youtube.com/watch?v=zwibgNGe4aY Le transfert de l’information génétique La réplication de l’ADN Durant la réplication, les brins d’ADN se séparent et chaque brin sert de modèle pour la synthèse d'un brin complémentaire La réplication assure donc le transfert de l’information génétique d’une cellule à ses descendantes. . https://www.youtube.com/watch?v=oebogqrX5F4 Principales techniques de biologie moléculaire La PCR La PCR ou « la réaction en chaîne par polymérase » a été crée par Kary Mullis qui a obtenu un prix Nobel en 1993 pour cette découverte C’est une importante découverte pour la science car la technique permet d’amplifier des segments spécifique de l’ADN en grande quantité La procédure a évolué au cours des années mais le principe de base est assez simple La PCR La réaction est exponentielle et faire intervenir deux acteurs principaux : La Taq Polymerase, une enzyme qui résiste aux fortes températures qui a été isolée à partir de la bactérie thermophile Thermus aquaticus qu’on trouve à proximité des sources chaudes Des dNTPs (DésoxyNucléotides-Tri- Phosphates), sont les éléments de base utilisés par la Taq Pol pour synthétiser les brins d'ADN complémentaires (brique de construction) La PCR La PCR se déroule en 3 phases : Dénaturation : séparation des deux brins d’ADN grâce à l’élévation de la température Appariement des amorces : suite à la diminution de la température, les amorces spécifiques complémentaires de l’ADN à amplifier vont s’hybrider sur le brin d’ADN Elongation : synthèse du brin complémentaire grâce à la Taq polymérase qui va ajouter les nucléotides (dNTPs) présents dans le milieu de réaction à l’extrémité des amorces La PCR Les différentes étapes de la PCR se déroulent à des températures différentes La PCR La PCR est une réaction exponentielle qui utilise les produits de chaque étape comme matrice des étapes suivantes. Ce processus va générer des milliers de copies En pratique, la réaction se réalise dans des tubes spéciaux qu’on va placer dans un appareil qui va permettre de régler les températures pour chaque étape: un thermocycleur Séquençage de l’ADN Cette technique va permettre de connaître la succession des nucléotides qui composent une partie d’une molécule d’ADN La technique du séquençage de Sanger est la plus utilisée : Semblable au processus de PCR, la différence étant l’incorporation de ddNTP (didésoxyribonucléotides) au lieu de dNTP : la polymerase n’est plus capable d’ajouter le moindre nucléotide à la suite et la synthèse du brin d’ADN s’arrête On obtient un ensemble de brins d'ADN de tailles variées, selon l'endroit où un ddNTP se sera inséré et que la réaction aura ainsi été stoppée Séquençage de l’ADN Séquençage de l’ADN Cette technique est parfois remplacée par du « Next Generation Sequencing », qui permet d’obtenir un génome complet mais : Coût plus élevé Beaucoup plus de données à analyser Intéressant uniquement dans le cadre de gros projet, pas en routine Quelques concepts de phylogénie moléculaire Phylogénie moléculaire La phylogénie moléculaire consiste à utiliser des méthodes informatiques pour retracer « l’histoire » des mutations apparues au cours de l’évolution d' un gène donné, en comparant les séquences de différentes espèces plus ou moins proches Si on veut comparer les séquences, on doit les aligner, on appelle ca un alignement de séquences. Phylogénie moléculaire Un programme gratuit permet de réaliser ces alignements : MEGA (Ouvrir et montrer) Phylogénie moléculaire Après l’alignement, on peut voir quelles mutations ont eu lieu : Transitions entre purines ou entre les pyrimidines Transversions d’un purine vers une pyrimidine Délétions ou insertions A C G T Phylogénie moléculaire Il y a différentes méthodes pour réaliser un alignement et le choix de telle ou telle méthode va dépendre des données à analyser et du type d’analyse qu’on souhaite effectuer On trouve des tabelles par example dans le ‘phylogenetic handbook’ Si on ne possède pas assez de séquences et qu’on veut agrandir notre dataset, on peut regarder s’il y a des séquences des espèces qui nous intéressent sur GENBANK (+ montrer GENBANK et montrer BLAST) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ Phylogénie moléculaire On peut ensuite construire un arbre phylogénétique, en regroupant d’abord les séquences les plus similaires, puis progressivement celles qui sont les plus différentes Pour construire les arbres phylogénétiques, on a besoin d’un modèle d’évolution des séquences nucléotidiques qui va évaluer : L’évolution d’une séquence par rapport à sa séquence ancestrale La divergence de deux séquences entre elles Phylogénie moléculaire Il y a différents modèles d’évolution qui vont analyser les taux de substitutions, la fréquence des bases, le nombre de transitions ou de transversions, les possibilités de mutations avec différents paramètres En cas de doute on utilise GTR, ca rends compte avec tout On a des résultats différents avec des modèles dévolution différents donc il faut choisir le plus adapté ! Deux arbres phylogénétiques différents, sur base des mêmes données mais en utilisant deux modèles d’évolution différents ! Phylogénie moléculaire Si on a le model correct il y a encore des différents possibilités Les méthodes utilisent des autres techniques pour construire un arbre On a besoin de différents programmes pour utiliser de différents méthodes (Neighbour joining, bayesian analysis, maximum likelihood, maximum parsimony) Tous les méthodes vont utiliser des différents manières pour construire des arbres phylogénétique Pour plus d’information ‘phylogenetic handbook’ Phylogénie moléculaire En cas de doute sur la méthode à choisir, c’est toujours mieux de faire des arbres phylogénétiques avec toutes les méthodes et après comparer les résultats Pour avoir une première impression on peut déjà construire quelques arbres dans MEGA DNA Barcoding DNA Barcoding Le DNA Barcoding ou la méthode du “code-barres ADN” est une technique qui permet une identification moléculaire en se basant sur la comparaison de courtes séquences d’ADN mitochondrial Un bon code-barres ADN est : Une séquence variable entre espèces mais très conservée au sein d’une même espèce, ce qui lui confère un fort pouvoir discriminant Une séquence assez courte pour pouvoir séquencer mais suffisamment longue pour avoir assez d’information En général, on utilise le fragment d’un gène codant pour la première sous-unité de la cytochrome oxydase (COI) qui a une longueur de 650 bp DNA Barcoding Le DNA barcoding est utilisé pour différentes raisons : Identification des espèces cryptiques dont la morphologie est quasi identique ce qui rend leur distinction difficile Identification de spécimens incomplets, afin d’identifier l’espèce à laquelle une touffe de poils ou une patte d’insecte appartient Identification d’espèces à large échelle pour étudier la biodiversité et les risques environnementaux Identification des espèces invasives Découverte de nouvelles espèces Association de mâles et femelles d'une même espèces (lorsque les mâles et les femelles sont dimorphiques Association des stades de développement chez une même espèce … DNA Barcoding Confirmation of morphological studies e.g. revision of Hepsetus DNA Barcoding MAIS on ne peut pas remplacer les analyses taxonomiques par les techniques moléculaire ! Le DNA barcoding peut aider et faciliter le processus d’indentification et permettre la découverte de nouvelles espèces ou répondre à d’autres questions biologiques mais ne peut en aucun cas remplacer la taxonomie classique DNA Barcoding Le barcoding moléculaire est une campagne qui est largement financée à travers le monde, comme le suggère ces différentes organisations : « Barcode of Life Data Systems » (BOLD) : www.boldsystems.org « Consortium for Barcode of Life » (CBOL) : http://www.barcodeoflife.org/ « European Consortium for the Barcode of Life »: http://www.ecbol.org/ « international Barcode of Life » (iBOL): www.iBOL.org « The Belgian Network for DNA Barcoding » (BeBOL) : http://bebol.myspecies.info/ « Canadian Centre for DNA Barcoding » (CCDB) : http://www.ccdb.ca/ « The Fish Barcode of Life Initiative » (Fish-BOL) : http://www.fishbol.org/ …. DNA Barcoding Mais tout n’est pas si simple en pratique… Les primers décrits dans la littérature ne sont pas si universels que ça et parfois, beaucoup de mises au point sont nécessaires Questions?
