REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE D’ORAN ES SENIA FACULTE DES SCIENCES DEPARTEMENT DE BIOLOGIE LABORATOIRE DE PHYSIOLOGIE VEGETALE MEMOIRE Présenté par Melle ELFERIHA SIHEM Pour l’obtention du DIPLOME DE MAGISTER Spécialité : PHYSIOLOGIE VEGETALE Option : Écophysiologie végétale Intitulé Influence de la salinité sur la formation des nodosités chez la fève (Vicia faba L.). Soutenu devant les membres du jury : M. MAROUF Abderrezak Professeur Président Université d'Oran M.HADJADJ AOUL Seghir Professeur Examinateur Université d'Oran Melle BOUABDALLAH Louiza M. C. A Examinatrice Université d'Oran M. BELKHODJA Moulay Professeur Rapporteur Université d'Oran Promotion 2009-2010 Remerciements Remerciements J’ai réalisé la présente étude à l’Université d’ES- Sénia-Oran au sein du Laboratoire de Physiologie Végétale. J’ai effectué ce travail grâce à l’aide de nombreuses personnes auxquelles je tiens aujourd’hui adresser tous mes très sincères remerciements. Je veux tout d’abord remercier, mon directeur de thèse, le Professeur BELKHODJA Moulay, pour m’avoir accueillie dans son laboratoire, puis pour m’avoir fournie les moyens nécessaires à la réalisation de ce mémoire. Il a su se rendre disponible dés que nécessaire et, par sa capacité de synthèse, me conseiller quotidiennement, avec pertinence et enfin, pour toute la confiance qu’il m’a constamment témoignée quant à la gestion de ce mémoire. Mes remerciements vont également aux membres du jury, qui ont accepté la lourde de tâche d’éplucher ce manuscrit . Je suis très honoré que Messieurs, le professeur MAROUF Abderrezak , le Professeur HADJADJ AOUL Seghir et Mademoiselle BOUABDALLAH Louiza aient accepté de faire partie de mon jury de thèse .Qu’ils soient assurés de ma profonde reconnaissance pour le temps qu’ils lui auront accordé. Je tiens à remercier toutes les personnes qui sont intervenues de prêt ou de loin au cours de ce mémoire, sur le terrain ou au laboratoire, et dont l’appui technique, très efficace, a largement contribué à l’aboutissement de ce projet de mémoire. Sans eux, rien n’aurait était possible ! Je veux remercier en premier lieu Melle ACHOUR Asma et Melle BOUMIA Ouahiba, les deux expertes de la culture en serre,qui ont su me faciliter la tâche quant à la gestion de mes cultures en serre, je les remercie également pour la grande disponibilité dont elles ont fait preuve en m’apportant leur aide, efficace et rigoureuse, pour toutes les récoltes effectuées en serre . J’ai toujours pu compter sur elles et eu confiance en elles, me permettant de reposer sur elles les yeux fermés. Merci, , au personnel du “Laboratoire El FETH”, sans l’aide de qui la conduite des expérimentations in situ se serait avérée bien difficile. Je les remercie pour m’avoir fait Remerciements bénéficier d’un matériel ingénieux et de qualité, de leurs compétences techniques, de leur aide si précieuse et de l’accueil chaleureux qu’ils m’ont chaque fois réservé. Merci à Melle Bouchikh Amina pour m’avoir appris à maîtriser le logiciel de statistiques que je saurais maintenant initier à d’autres ! Je veux aussi remercier l’ensemble des personnes faisant partie du Laboratoire d’Physiologie Végétale, enseignants, technicienne, et étudiants grâce auxquelles la bonne ambiance a toujours régné. Un grand merci à Mr le Directeur de l’Institut Technique de Pêche et de l’Aquacultre d’Oran, j’ai nommé Mr RAHMANI Youcef. Je suis également très reconnaissante à Mr le directeur du personnel , j’ai nommé Mr KOUICEM Houari pour sa grande disponibilité et son aide. Merci à mes collégues et amis, Mme SANDOUK Djamila, Mme CHAIBI Malika et Melle BENZAMIA Ikram pour m’avoir aidée face aux difficultés, voire subtilités, du monde! et pour leurs écoute, leurs amitié toujours réconfortante. Merci à Mr MAZOUZ Mohamed, collègue et amis pour ces précieux conseilles. J’adresse un grand merci à Mr BENDRAOUA Abdelaziz, docteur à l’université de l’USTO-Oran, pour son aide si précieuse, ainsi qu’a Mr SEBAA Lonsri pour son intérêt et ces conseils . Enfin je veux remercier l’ensemble de mes amis dont l’amitié et le soutien moral m’ont permis de garder le cap. La décompression a toujours été de rigueur grâce à eux! Un immense merci à mes parents, mes frères, Amine, Fayçal et Yassine ; mes belles sœurs, Kenza et Mounia, ainsi mes neveux, Anis, Iheb et Akram pour leur affection inestimable et pour m’avoir toujours soutenue et encouragée dans la voie que j’avais choisie, puis pour avoir largement supporté mon “sale caractère” et mes sautes d’humeur dans la dernière ligne droite de ce mémoire. Merci à mon cher papa pour m’avoir fait bénéficier de ses connaissances en langue française, et surtout pour sa confiance. Merci à ma chère maman pour sa patience quotidienne, qui a suivi et subi au plus près cette expérience, qui a su écouté mes doutes récurrents, me réconforter quand je fléchissais et m’encourager constamment. RESUME Dans le présent travail, des bactéries isolées à partir des nodules de la légumineuse Vicia faba L. caractérisés par une étude phénotypique qui donne une description comparable à celle des Rhizobium, un test de nodulation dans des conditions bactériologiquement contrôlées est effectué en mettant en évidence l’aptitude des isolats à noduler les racines de la plante hôte qui a montré la formation des nodules ce qui indique que nos isolats sont infectifs et elle (cette formation) confirme la relation symbiotique entre la plante hôte et le micro-symbion qui est une relation spécifique. Afin d’étudier l’effet du stress salin au NaCl à 50 meq.l-1 et 200meq.l-1 et au NaCl+CaCl2 aux mêmes concentrations, ainsi qu’a l’eau de mer à 25%, 50% et 100%, et de l’inoculation par des bactéries symbiotiques sur la production de la biomasse sèche et la quantité d’azote accumulée de la fève, ainsi que le nombre de nodules obtenus par plante, des essais ont été menés au champ dans une serre contrôlée, sur des plantes de Vicia faba L. âgées de six semaines. Les résultats ont montré que l’application du stress salin exerce une action dépressive et a entrainé une chute considérable de la production de matière sèche aérienne, une augmentation du poids sec racinaires est provoquée par la salinité croissante au NaCl, NaCl+ CaCl2 à 50 meq.l-1 et à l’eau de mer, tandis qu’une diminution de la biomasse sèche racinaire de 2.5% est noté chez les plantes traitées à 200 meq.l-1 de NaCl+ CaCl2. L’apport d’une solution saline au NaCl conduit a une augmentation de la biomasse nodulaire produite de 136% à 50 meq.l-1 et de 92.5% à 200 meq.l-1. Tandis que l’ajout de NaCl +CaCl2 provoque une augmentation de l’effectif nodulaire de 151.6% pour une concentration de 50 meq.l-1, alors qu’il induit une diminution de 19.6% pour une concentration de 200 meq.l-1. Les plantes agissent indistinctement à l’application du stress à l’eau de mer. Les variations de la quantité d’azote total de la partie aérienne en fonction des traitements, se trouve fortement affectée par la contrainte saline. L’addition du NaCl à 50 meq.l-1et 200 meq.l-1crée une baisse respectivement de 7.1% et 45%, l’application du NaCl+ CaCl2 à 50 meq.l-1 provoque une chute de la teneur en azote, les parties aériennes demeurent plus riches en azote sous contrainte par le NaCl+ CaCl2 à 200 meq.l-1 Le stress à l’eau de mer à différentes concentrations a entrainé une baisse des quantités d’azote dans les parties aériennes. Mots-clés : Azote, inoculation, fève (Vicia faba L.), stress salin, Rhizobium, nodules. ABSTRACT In the present study, bacteria isolated from nodules of the legume Vicia faba L. characterized by a phenotypic study gives a description comparable to Rhizobium nodulation test bacteriologically controlled conditions is made by demonstrating the ability of isolates to nodulate the roots of host plants showed that the nodulation indicating that our isolates are infective and it (the training) confirms the symbiotic relationship between host plant and the micro-Symbion is a specific relationship. To study the effect of salt stress with NaCl 50 meq.l-1and 200meq.l-1 and NaCl + CaCl2 at the same concentrations, and seawater at 25%, 50% and 100 %, and the inoculation of symbiotic bacteria on the production of dry biomass and nitrogen accumulation of the bean, and the number of nodules produced per plant, tests were conducted in a greenhouse controlled field , on plants of Vicia faba L. aged six weeks. The results showed that the application of salt stress exerts a depressant and has caused a huge drop in production of dry air, an increase of root dry weight is caused by increased salinity in NaCl, NaCl + CaCl2 50 meq.l-1 and sea water, while a decrease of root dry biomass of 2.5% was noted in plants treated at 200 meq.l-1 NaCl+CaCl2. The addition of NaCl led to an increase in nodule biomass produced from 136% to 50 meq.l-1 and 92.5% to 200 meq.l-1. While the addition of NaCl + CaCl2 caused an increase in the number of nodular 151.6% at a concentration of 50 meq.l-1, then it induces a decrease of 19.6% at a concentration 200-meq.l 1. The plants act indiscriminately to the application of stress to the seawater. Changes in the amount of total nitrogen in the aerial part based treatment, is strongly affected by salt stress. The addition of NaCl to 50 meq.l-1 and 200 meq.l-1 Create decreased respectively by 7.1% and 45%, application of NaCl + CaCl2 50 meq.l-1 causes a drop in nitrogen content, aerial parts are richer in nitrogen stress by NaCl+CaCl2 200 meq.l-1. Stress in seawater at different concentrations has resulted in lower amounts of nitrogen in the shoots. Key words : Nitrogen, inoculation, bean (Vicia faba L.), salt stress, Rhizobium, nodules. Liste des figures LISTE DES FIGURES Liste Des Figures De La Partie Synthèse Bibliographique : Fig.1- Aspect général de Vicia faba L............................................................................10 Fig.2 - Apport calorifique de 100 g de la fève verte d'Aguadulce ………………..........12 Fig.3 – Cycle de l’azote………………………...…………………………………………13 Fig.4- Représentation schématique des possibles interactions (positives ou négatives) rhizosphériques où les exsudats racinaires jouent un rôle……………………….18 Figure.5- Structure de la nitrogénase d'Azotobacter vinelandii obtenue par diffraction des rayonsX………………………………………………………………………...22 Figure.6- production de l'ammoniac à partir d’azote atmosphérique…………….…….23 Figure.7- Échange de signaux dans la symbiose Rhizobium- Fabacée ……………….…25 Figure.8- Déformation des poils racinaires chez le haricot ………………………….…..32 Figure.9- Infection intracellulaire et différenciation du Symbiosome chez les légumineuses ………………………………………………………………………….……....34 Figure.10- Développement des nodules sur les racines dans un cas de symbiose entre Rhizobium et une plante …………………………………………..…………35 Liste Des Figures De La Partie Matériel et Méthodes : Fig. 1- Plantules de Vicia faba L. cultivées en alvéoles……………………………..…...38 Fig. 2- Dispositif expérimental ……………………………………………..…………….40 Fig. 3- Conservation des nodules ……………………………………..…………………..42 Fig. 4- Stade floraison de Vicia faba L…………………………...……………………….44 Fig. 5- préparation du broyat végétal …………………………..…………………………44 Fig. 6- Agitation et filtration de la solution de terre ………………………..…………….47 Liste Des Figures De La Partie Résultats : Fig.1- Poids sec (g/plante) mesuré après une semaine de stress au NaCl dans la partie aérienne de Vicia faba L. âgée de six semaines ……….………………………...48 Liste des figures Fig.2- Poids sec (g/plante) mesuré après une semaine de stress au NaCl+ CaCl2 dans la Partie aérienne de Vicia faba L. âgée de six semaines………………………..…49 Fig.3- Poids sec (g/plante) mesuré après une semaine de stress à l'eau de mer dans la partie aérienne de Vicia fabaL. âgée de six semaines ……………………………………50 Fig.4- Poids sec (g/plante) mesuré après une semaine de stress au NaCl dans les racines de Vicia faba L. âgée de six semaines………………………………...51 Fig.5- Poids sec (g/plante) mesuré après une semaine de stress au NaCl+ CaCl2 dans les racines de Vicia faba L. âgée de six semaines ……………………...…………...52 Fig.6- Poids sec (g/plante) mesuré après une semaine de stress à l'eau de mer dans les racines de Vicia fabaL. âgée de six semaines……………………………….……53 Fig.7- Nombre de nodules (nodules/plante) après une semaine de stress au NaCl dans les racines de Vicia fabaL. âgée de six semaines ……………………………….……54 Fig.8- Nombre de nodules (nodules/plante) après une semaine de stress au NaCl +CaCl2 dans les racines de Vicia fabaL. âgée de six semaines……………………………………..55 Fig.9- Nombre de nodules (nodules/plante) après une semaine de stress à l’eau de mer dans les racines de Vicia fabaL. âgée de six semaines……………………………………..56 Fig.10- Teneurs en azote total (mg.kg⁻1.Ps) après une semaine de stress au NaCl dans la partie aérienne de Vicia fabaL. âgée de six semaines……………………………………...57 Fig.11- Teneurs en azote total (mg.kg⁻1.Ps) après une semaine de stress au NaCl+ CaCl2 dans la partie aérienne de Vicia fabaL. âgée de six semaines……………………………58 Fig.12- Teneurs en azote total (mg.kg⁻1.Ps) après une semaine de stress à l’eau de mer dans la partie aérienne de Vicia fabaL. âgée de six semaines……………………………….59 Fig.13- Ratios partie aérienne (tiges et feuilles)/partie racinaire du poids sec(g) après une Liste des figures semaine de stress semaines………………….60 au NaCl de Vicia faba L. âgée de six Fig.14- Ratios partie aérienne (tiges et feuilles)/partie racinaire du poids sec(g) après une semaine de stress au NaCl+CaCl2 de Vicia faba L. âgée de six semaines………..61 Fig.15- Ratios partie aérienne (tiges et feuilles)/partie racinaire du poids sec(g) après une semaine de stress à l’eau de mer de Vicia faba L. âgée de six semaines…………..62 Fig.16- Ratios du Nombre de nodules / Teneurs en azote total après une semaine de stress au NaCl de Vicia fabaL. âgée de six semaines…………………………………………63 Fig.17- Ratios du Nombre de nodules / Teneurs en azote total après une semaine de stress au de Vicia fabaL. âgée de six NaCl+CaCl2 semaines…………………………………64 Fig.18- Ratios du Nombre de nodules / Teneurs en azote total après une semaine de stress à l’eau de mer de Vicia fabaL. âgée de six semaines………………………………….64 Fig.19- Ratios du Nombre de nodules / poids sec de la partie racinaire après une semaine de stress au NaCl de Vicia fabaL. âgée de six semaines………………………………..65 Fig.20- Ratios du Nombre de nodules / poids sec de la partie racinaire après une semaine de stress au NaCl+CaCl2 de Vicia fabaL. âgée de six semaines………………………..66 Fig.21- Ratios du Nombre de nodules / poids sec de la partie racinaire après une semaine de stress à l’eau de mer de Vicia fabaL. âgée de six semaines……………………….…66 Liste des figures Fig. 22- Aspect macroscopique des souches de Rhizobiums sp. Sur milieu YEM après 48h d’incubation à 28°C………………………………………………………………….67 Liste des tableaux LISTE DES TABLEAUX Liste Des Tableaux De La Partie Synthèse Bibliographique : Tableau 1 - Composés contenus dans les exsudats racinaires des Fabacées qui induisent les gènes nod des bactéries Rhizobium.………………………………………...24 Tableau 2 - Taxonomie des rhizobia selon leur vitesse de croissance………………….........29 Tableau 3 - Taxonomie actuelle des bactéries nodulant les légumineuses……………..........30 Liste Des Tableaux De La Partie Matériel et Méthodes : Tableau 1- Composition minérale de la solution nutritive de Hoagland (1938)……………41 Tableau 2 - Composition de la solution saline……………………………………………….41 Liste Des Tableaux De La Partie Résultats : Tableau 1- Test statistique de signification de Fisher (P= 5%) du poids sec (g/plante) des parties aériennes (tiges+feuilles) de Vicia faba L. âgée de six semaines, stressée au NaCl. à l’aide du logiciel SPSS…………………………………………………..48 Tableau 2- Test statistique de signification de Fisher (P= 5%) du poids sec (g/plante) des parties aériennes (tiges+feuilles) de Vicia faba L. âgée de six semaines, stressée au NaCl+ CaCl2……………………………………………………………………...49 Tableau 3- Test statistique de signification de Fisher (P= 5%) du poids sec (g/plante) des parties aériennes (tiges+feuilles) de Vicia faba L. âgée de six semaines, stressée à l'eau de mer……………………………………………………………………..50 Tableau 4- Test statistique de signification de Fisher (P= 5%) du poids sec (g/plante) des racines de Vicia faba L. âgée de six semaines, stressée au NaCl…………..51 Tableau 5- Test statistique de signification de Fisher (P= 5%) du poids sec (g/plante) des racines de Vicia faba L. âgée de six semaines, stressée au NaCl+ CaCl2….52 Tableau 6- Test statistique de signification de Fisher (P= 5%) du poids sec (g/plante) des racines de Vicia faba L. âgée de six semaines, stressée à l’eau de mer…...53 Tableau 7- Test statistique de signification de Fisher (P= 5%) des Nombre de nodules (nodules/plante) dans les racines de Vicia fabaL. âgée de six semaines. stressée au NaCl…………………………………………………………………………54 Liste des tableaux Tableau 8- Test statistique de signification de Fisher (P= 5%) des Nombre de nodules (nodules/plante) dans les racines de Vicia fabaL. âgée de six semaines. stressée au NaCl +CaCl2…………………………………………………………………....55 Tableau 9- Test statistique de signification de Fisher (P= 5%) des Nombre de nodules (nodules/plante) dans les racines de Vicia fabaL. âgée de six semaines. stressée à l’eau de mer……………………………………………………………………56 Tableau 10- Test statistique de signification de Fisher (P= 5%) de la teneur en azote total (mg.kg⁻1.Ps) de Vicia fabaL. âgée de six semaines. stressée au NaCl………..57 Tableau 11- Test statistique de signification de Fisher (P= 5%) de la teneur en azote total (mg.kg⁻1.Ps) de Vicia fabaL. âgée de six semaines. stressée au NaCl+ CaCl2..58 Tableau 12- Test statistique de signification de Fisher (P= 5%) de la teneur en azote total (mg.kg⁻1.Ps) de Vicia fabaL. âgée de six semaines. stressée à l’eau de mer…59 Abréviations ABREVIATIONS ATP Adénosine triphosphate ATPase Adénosine triphosphate synthétase cm Centimètre g Gramme h Heure ha Hectare Kg Kilogramme l, L Litre m Masse M Molaire MF Matière fraîche mg Milligramme min Minute ml Millilitre mm Millimètre mM Millimolaire MS Matière sèche PGPR Plant growth-promoting rhizobacteria pH Potentiel hydrogène S Seconde µl Microlitre µM Micromolaire % Pour cent °C Degré Celsius Ca Calcium Abréviations CaCl2 Chlorures de calcium CE Conductivité électrique CO2 Dioxyde carbone S Soufre FAO Food and Agriculture Organisation Fe Fer Fig. Figure LegHb Leghémoglobine Tab Tableau NaCl Chlorure de sodium NiR Nitrite Réductase NO2 - Nitrite (dioxyde d’azote) NO3 - Nitrate O3 Ozone PS II Photosystème II SO4 -- Sulfate NR Nitrate Réductase Meq.l-1 Milli équivalant/Litre NH4 Ammonium ANR Activité de la nitrate réductase mMhos/cm Millimhos par centimètre O2 Oxygène NHI Nitrogen Harvest Index OAS O-acétylsérine NaNO3 Nitrate de Sodium NH4NO3 Nitrate d'ammonium PGPRs Bactéries activant la croissance des plantes MVA Mycorhizes à vésicules et arbuscules QS Quorum sensing BNL Bactéries Nodulant les Légumineuses PHB Polyhydroxybutyrate Table des matières INTRODUCTION…………………………………………………………………………1 CHAPITRE I - SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE………………………………..4 I-LES STRESS ABIOTIQUES………………………………………………………….5 1- Définition du stress……………………………………………………………………...5 2- Le stress salin……………………………………………………………………………..6 2-1 Impact de la salinité sur les plantes…………………………………………………...7 • Effet de salinité sur la réduction générale de la croissance…………………….7 • Effets de salinité sur les feuilles………………………………………………..7 • Effets de salinité sur la photosynthèse………………………………………....8 • Effets de salinité sur la germination…………………………………………....8 • Effets de salinité sur les racines………………………………………………...8 • Effet de salinité sur le métabolisme azoté……………………………………..9 3- Le stress thermique…………………………………………………………………………9 4- Le stress hydrique………………………………………………………………………….9 5- Le stress ionique…………………………………………………………………………...10 II- LA PLANTE : Vicia faba L........................................................................................11 1- Généralités sur la fève………………………………………………………………….11 1-1-Description………………………………………………………………………….11 1-2-Caractères taxonomiques…………………………………………………………...12 2- Origine, répartition géographique et écologie…………………………………………….12 3-Intérêts économiques………………………………………………………………………13 III-la relation symbiotique : fève- rhizobiums............................................................14 1- L’azote et la plante…………………………………………………………………...14 1-1-Cycle de l’azote………………………………………………………………….14 1-2-Assimilation de l’azote par la plante…………………………………………….16 a) Nutrition azotée……………………………………………………………………..16 b) Absorption de l’azote………………………………………………………………..16 1. Systèmes de transport impliqués…………………………………………………….16 2. Absorption et assimilation du nitrate par les racines………………………………...17 3. Régulation de l’absorption du nitrate………………………………………………..17 La fixation de l'azote………………………………………………………...18 1- La fixation industrielle de l'azote……………………………………………18 2- La fixation biologique de l'azote…………………………………………….18 2-1- Interactions entre les plantes et les micro-organismes du sol………………19 2-1-1- Les symbioses mycorhiziennes…………………………………………...20 2-1-2- Les bactéries activant la croissance des plantes (bactéries PGPR)………21 2-1-3- Les symbioses fixatrices d’azote………………………………………....22 a- La nitrogénase bactérienne………………………………………………....23 b- Génétique de la Fixation……………………………………………………24 1- Les flavonoïdes………………………………………………………………25 2- Le gène nod D………………………………………………………………..27 3- Les gènes nif………………………………………………………………….28 c- Les rhizobiums……………………………………………………………..29 1- Définition et intérêt……………………………………………………..29 2- Principales caractéristiques…………………………………………….29 3- La taxonomie des rhizobiums…………………………………………..30 d- Mécanisme de la nodulation………………………………………………..33 1- Formation des bactéroïde……………………………………………….33 2- Les étapes de la nodulation……………………………………………..34 2-1- Préinfection………………………………………………………..34 2-2- L’infection…………………………………………………………35 2-3- Développement du nodule…………………………………………35 2-4- Structure du nodule………………………………………………..38 e- Tolérance et effet de la salinité sur la croissance des rhizobiums…………..38 f- L’osmorégulation chez les rhizobiums……………………………………..39 CHAPITRE II- MATERIEL ET METHODES……………………………………..40 I- MATERIEL VEGETAL…………………………………………………………………..40 II- MATERIEL BIOLOGIQUE……………………………………………………………..40 III-CONDUITE DE L’ESSAI……………………………………………………………….40 Préparation du substrat de culture…………………………………………………41 Solution nutritive et solution saline………………………………………………..43 Récolte et conservation des nodules………………………………………………44 Inoculation par les rhizobiums……………………………………………………...44 Isolement et conservation des souches de rhizobium……………………………...45 Identification……………………………………………………………………....45 1- Morphologie…………………………………………………………………...45 1-1- Réalisation du frottis…………………………………………………………45 IV- PARAMETRES MESURES……………………………………………………………46 Nombre de nodules par plante……………………………………………………….46 Détermination du poids sec…………………………………………………………..47 Dosage de l’azote total……………………………………………………………….47 1. Minéralisation de type Kjeldahl classique (en milieu acide sulfurique)………….48 1.1 Alcalinisation du milieu minéralisé et entraînement à la vapeur de l’ammoniac formé…………………………………………………………………………..49 1.2 Dosage de l'ammoniac recueilli………………………………………………..49 Cas du dosage indirect (ou en retour)………………………………………..49 Conductivité électrique du sol……………………………………………………….49 V- analyse statistique........................................................................................................50 CHAPITRE III- RESULTATS.......................................................................................51 I – Variations du poids sec des plantes selon les différents stress salin…………………….51 1 – Partie aérienne………………………………………………………………………..51 2 – Partie racinaire……………………………………………………………………….54 II- Dénombrement des nodules des plantes sous différents stress salin……………………..57 III- Dosage de l’azote total de la partie aérienne des plantes sous différents stress salin…...57 IV- Variations des ratios……………………………………………………………………...60 1 – Ratio partie aérienne (tiges et feuilles)/partie racinaire du Poids sec………………...64 2 – Ratios du Nombre de nodules / Teneurs en azote total……………………………….67 3 – Ratios du Nombre de nodules / poids sec de la partie racinaire………………………70 V- Isolement et purification des souches de rhizobiums…………………………………….72 1- Examen macroscopique……………………………………………………………...72 2- Examen microscopique………………………………………………………………73 VI- Conductivité électrique (CE)……………………………………………………………73 DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALES………………………………..75 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES..................................................................82 ANNEXE............................................................................................................................. Introduction Introduction Le concept biologique du stress chez les plantes apparaît avec des significations différentes, qui convergent principalement en attribuant le stress à n’importe quel facteur environnemental qui limite la productivité (LEVITT, 1980 ; LICHENTHALER, 1996). Dans le cas de stress salin, une double problématique se pose à l’organisme végétal : d’un côté, la présence de sel, en abaissant le potentiel hydrique du sol, menace l’approvisionnement en eau de la plante. De l’autre, l’absorption de sel dans les tissus menace le bon fonctionnement physiologique des cellules (ZHU, 2001). La salinité et la sécheresse constituent des contraintes majeures limitant considérablement la production végétale sur 40 % de la surface terrestre, notamment en régions méditerranéennes (FAO, 1988 ; MUNNE-BOSCH et ALEGRE,2004). La tolérance des végétaux aux sels est un phénomène complexe impliquant des particularités morphologiques et de développement avec des mécanismes physiologiques et biochimiques variés (BELKHODJA,1996). Certains sols sont riches en éléments nutritifs adsorbés sur les argiles ou la matière organique. De nombreuses plantes y poussent et la compétition est intense. D’autres sols, les sols sableux par exemple, sont au contraire pauvres et contiennent ou retiennent peu d’éléments nutritifs (BABO et al., 2002). Parmi les éléments nutritifs nécessaires, celui qui est le plus souvent limitant pour la croissance des plantes est l’azote. L’azote exploitable existe sous différentes formes dans le sol (ammonium, nitrite, nitrate ou encore des formes organiques). Le cycle de l’azote est donc central pour le fonctionnement des écosystèmes. Le cycle met également en jeux des fixateurs d’azote, tous procaryotes, qui peuvent transformer le diazote inorganique de l’atmosphère en acides aminés assimilables. La fixation biologique de l’azote consiste à réduire le diazote, une transformation biochimique très coûteuse énergiquement car ce dernier est très stable, et l’énergie nécessaire à la fixation biologique prend souvent sa source dans la photosynthèse. Il y a donc peu de fixation biologique non couplée à la photosynthèse et les fixateurs les plus efficaces sont ceux qui ont établi une relation stable avec des plantes, une symbiose, comme celle associant la bactérie Rhizobium et les légumineuses (PERRET et al., 2000). 1 Introduction La symbiose intracellulaire entre les diverses bactéries du sol, par exemple rhizobiums, et les plantes de la famille des légumineuses aboutit à la formation de structures appelées nodosités sur les racines des plantes et parfois sur les tiges dans le cas de légumineuses aquatiques (MICHELLE et LINDEQUE, 2006). Dans les cellules de ces nodosités, les bactéries se différencient en bactéroïdes, capables de réduire l’azote atmosphérique N2 en une forme assimilable par la plante-hôte (RASANEN, 2002). Par contre, la plante fournit aux bactéries une niche dans laquelle elles peuvent se multiplier abondamment et des composés carbonés issus de la photosynthèse (AHMAD & ABDIN.,2000 ; CHANDRASEKAR et al.,2000). Cette interaction constitue donc une « symbiose », puisque les deux partenaires vivent en contact étroit, et un « mutualisme», puisqu’il s’agit d’une association à bénéfice réciproque (GORDON et al., 2001). Grâce à cette symbiose, les légumineuses sont capables de pousser dans des sols pauvres en azote minéral ou organique. Les bactéries nodulant les légumineuses (B.N.L.) comprenant notamment les espèces du genre Rhizobium sont des bactéries du sol, à Gram négatif, qui ont une signification scientifique et agronomique profonde due à leur capacité d'établir une relation symbiotique dans la fixation d'azote avec les légumineuses, relation d'importance majeure pour l'entretien de la fertilité du sol (SOMASEGARAN et HOBEN, 1994 ; INDERJIT et WESTON, 2003 ). Pour cette raison et en tenant compte de l'importance des légumineuses dans la consommation animale et humaine, une certaine attention est donnée à l’écologie des B.N.L. (habitats, effet des facteurs extrinsèques et intrinsèques, nutrition, … (IBEKWE et al., 1995). La famille des Fabacées est extrêmement diverse, avec environ 18 000 espèces au développement très varié, incluant de petites plantes herbacées annuelles, des arbustes, des lianes et des arbres (GOUGH, 2009). La salinité et la sécheresse ont des effets délétères sur la croissance et la survie des populations rhizobiennes dans le sol (SINGLOTON et al., 1988 ; BOULBABA et al,2009), sur le développement et le fonctionnement des nodosités et, donc, sur la capacité fixatrice de l'association symbiotique. La survie et la croissance des légumineuses en condition de contrainte hydrique ou saline est liée à des processus adaptatifs liés au transport et à la compartimentation des ions, à la biosynthèse et l'accumulation d'osmolytes organiques qui participent à l'ajustement osmotique et à des remaniements protéiques nécessaires au maintien de l'intégrité cellulaire (JEBARA et al., 2000). 2 Introduction Le métabolisme azoté et la synthèse protéique sont très perturbés par le stress osmotique qui affecte à la fois les populations rhizobiennes, la plante hôte et la relation symbiotique (BEN KHALED et al,2003). L’initiation nodulaire est extrêmement sensible à la contrainte osmotique en raison de la réduction des sites d’infection de la racine, du nombre de poils racinaires et de la proportion de ceux qui portent les cordons d’infection (ZAHRAN et al., 1986). Toujours en réponse à cette contrainte, un épaississement important des cortex nodulaires externe et interne est observé chez la luzerne. Parallèlement, les cellules non infectées contiennent de très nombreux amyloplastes, alors que les nodules développés en présence de NaCl en sont totalement dépourvus (LE RUDULIER et al., 1995). Les analyses effectuées au cours des dernières années à propos de l’effet des contraintes de l’environnement sur la croissance végétale sous climat méditerranéen indiquent que l’azote pourrait être l’un des facteurs les plus limitants de la production végétale et bien qu’il soit possible d’augmenter la productivité de certains sols au moyen d’engrais azotés, les faibles bénéfices économiques qui en résultent font que la fertilisation est impossible dans beaucoup de conditions. C’est le cas, notamment, des environnements les plus arides où la réponse de la plante est limitée par la faible disponibilité de l’eau durant une longue période de son cycle de vie. En raison de ce type de limitation, une attention particulière doit être accordée à la fixation biologique de l’azote au moyen de l’utilisation d’associations légumineuses-Rhizobium (JOHNSON et al., 1981; BECK et al., 1988; SANCHEZ-DIAZ et al., 1991) tandis que l’objectif du présent travail est d’étudier l’effet de l’inoculation par des bactéries symbiotiques et du stress salin à différentes concentrations de NaCl seuls et combinés avec le CaCl2 ainsi que de l’eau de mer sur la production de biomasse, la nodulation et la teneur en azote de la légumineuse communément cultivée en Algérie,la fève Vicia faba L. Le manuscrit comportera trois parties. La première regroupant les principales informations sur les différents stress abiotiques, la légumineuse Vicia faba .L, et la relation symbiotique fève –Rhizobiums sous forme d’une synthèse bibliographique. Dans la seconde partie, sera proposée la méthodologie adoptée dans cette expérimentation avec le matériel utilisé. Les principaux résultats obtenus suivis de la discussion feront l’objet de la troisième partie de ce travail achevée par une conclusion. 3 Chapitre I- Synthèse bibliographique CHAPITRE I - SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE I-LES STRESS ABIOTIQUES Les plantes sont immobiles et ne peuvent pas donc s’échapper des facteurs de stress abiotiques. Elles sont continuellement exposées aux différents facteurs de stress sans aucune protection (PUGNAIRE et VALLADARES,2007). Ceci leur permis de développer des mécanismes moléculaires pour faire face aux facteurs de stress ( JUAN et al., 2008) ; cependant des variations dans les mécanismes de tolérance existent entre les plantes (BIENIAWSKA et al.,2008). Certaines adaptations morphologiques des plantes leur font éviter ce stress mais ce n’est pas le cas chez toutes les plantes (XIAOLU et al., 2004). Les plantes altèrent leurs physiologies, leurs mécanismes métaboliques, l’expression de leurs gènes et leurs activités développementales pour faire face aux effets des stress ( GHELIS et al., 2008). Seules les plantes qui ont des meilleurs mécanismes de tolérance, de résistance et d’acclimatation peuvent survivre ( WILKINSON ,2000). 1- Définition du stress La plante dans son environnement est exposée aux différentes contraintes biotiques et abiotiques. La contrainte abiotique est le résultat des différentes conditions environnementales que ce soit climatiques ou édaphiques défavorables à la croissance des plantes (MUNNE-BOSCH et ALEGRE,2004). La plante du fait qu’elle ne peut pas se déplacer, elle doit s’adapter à ces conditions stressantes de manière à réduire leurs impacts sur son bon fonctionnement (LEXER,2005). Un stress abiotique est toute condition environnementale défavorable empêchant la plante de se développer normalement et de se reproduire (KOTCHONI et al.,2006). Ce stress peut être induit par une forte salinité (PARKER et al.,2006), des hautes températures (MAJOUL et al., 2003,2004), des basses températures (RENAUT et al.,2004; CUI et al.,2005; AMME et al., 2006), du déficit hydrique (ALI et KOMATSU, 2006; JORGE et al., 2006, GORANTLA,2007), de la lumière (NAM et al., 2003; PHEE et al.,2004), des métaux (REQUEJO et TENA,2005; SARRY et al., 2006), d'un stress oxydatif (COUEE et al.,2007), de la pollution et du déficit nutritionnel (MUNNE-BOSCH et ALEGRE,2004) ou d'une combinaison entre eux (LANGRIDGE et al.,2006). 4 Chapitre I- Synthèse bibliographique 2- Le stress salin La concentration en sel dans l’environnement d’une plante varie énormément, elle peut être insuffisante ou excessive, mais le stress salin s’applique surtout à un excès d’ions (DREVON et al.,2001). La salinité affecte presque 100 millions d’hectares de la totalité de ces sols est localisé dans les régions arides et semi arides du monde (SZABOLCS,1992) dont 80 millions se situent dans le bassin méditerranéen, plus de 40 % (HAMDY,1999 ; DREVON et al.,2001). D’après les données de la FAO, la salinité a affecté 20 à 30 millions d’ha des 260 millions de terres irriguées en l’an 2000, dans les steppes d’Asie Centrale, le taux des surfaces irriguées affectées par la salinisation atteint 50%, dans les pays du Maghreb et du Proche et Moyen Orient, ces pourcentages atteignent 30 à 40% (GUILLAUME,2000). L’Algérie connaît actuellement une évolution écologique irréversible caractérisée par un passage du régime semi aride à aride qui a couvert de grandes surfaces, cette aridité découle du phénomène de la sécheresse, résultat d’insuffisantes et irrégulières précipitations associées à d’importantes évaporation de l’eau des sols. (DAOUD et HALITIM,1994; BELKHODJA et BIDAI,2004). Le stress salin est défini par la présence de concentrations variées de NaCl. Les concentrations de NaCl supérieures à 50 mM dans les sols sont, en général, défavorables à la plupart des espèces végétales (en particulier celle que l'on regroupe sous le nom de glycophytes. Le NaCl en lui-même est toxique, mais le stress salin s'accompagne souvent d'une baisse importante du potentiel hydrique (KINET et al., 1998). Selon les recherches de CAMPBELL et PITMAN en 1971, le chlorure de sodium augmente la perméabilité ionique des membranes. En effet, les ions chlorures et sodium traversent les plantes par les racines, et sont véhiculés par le xylème vers les tiges et les feuilles, à ce niveau ils sont : - Soit stockés, et il s'agit de plantes de type "includers"; - Soit retenus et revéhiculés par le phloème jusqu'aux racines, il s'agit de plantes de type "exluders" (LEVIGNERON et al., 1995). La forte concentration en sel dans le milieu provoque une altération de la nutrition minérale et une perturbation des activités métaboliques s'exprimant par: - La synthèse des protéines et des acides nucléiques. - Le taux de respiration. - La photosynthèse et ses interactions (ALAM, 1994). 5 Chapitre I- Synthèse bibliographique a - Impact de la salinité sur les plantes Les fortes concentrations en sel altèrent la structure des sols; comme la diminution de la porosité, l’aération et la conductance hydrique des sols peuvent être affectées; des concentrations salines élevées génèrent de bas potentiel hydrique du sol, une forme de sécheresse physiologique créant une acquisition d’eau et de nutriments par les plantes, très difficile (SINGH et CHATRATH,2001; HOPKINS,2003). • Effet de salinité sur la réduction générale de la croissance La tolérance d’une culture à la salinité est une valeur relative basée sur les conditions de croissance de cette culture, la résistance au sel dépend de la complexité anatomique et physiologique de la plante (ZHU,2001). Le NaCl peut augmenter la croissance et le développement des plantes, mais à un certain taux, le sel peut nuire et endommager la croissance et le développement des plantes à cause du changement du potentiel osmotique, du déséquilibre ionique et de la toxicité ionique dans les cellules (GUERRIER,1983). En présence des conditions salines, une diminution dans la croissance de l’appareil végétatif aérien et une stimulation du développement racinaire ont été observées. Des irrigations avec une eau contenant 8 g/l de sel provoque une réduction de la biomasse aérienne (hauteur et surface foliaire) de certaines variétés de blé (M’BAREK et al.,2001). L’accumulation de sel dans les tissus de plantes au-dessus de la normale va causer une certaine inhibition du rendement (LAUCHLI et EPTEIN,1990; HIGAZY et al.,1995). • Effets de salinité sur les feuilles La salinité provoque de nombreux changements anatomiques de la feuille chez un certain nombre de plantes. Les feuilles de l’haricot, le coton et l’atriplex discernent une augmentation de l’épaisseur épidermique, l’épaisseur mésophyllienne, la longueur de cellules palissadiques, les diamètres du palissade et des cellules spongieuses suite à l’augmentation de la salinité (LONGSTRETH et NOBEL, 1979).En revanche, l’épaisseur épidermique et mésophyllienne et les espaces intercellulaires ont diminué sensiblement dans les feuilles de Brugueira parviflora traitées par NaCl (PARIDA et al., 2004). 6 Chapitre I- Synthèse bibliographique • Effets de salinité sur la photosynthèse La croissance des plantes, telle que la production de la biomasse, est une mesure principale de la photosynthèse nette et donc, la plupart des stress environnementaux et en particulier le stress salin diminuent la croissance et réduisent nettement le taux de la photosynthèse (KAWASAKI et al.,2001; CHAVES et al.,2008). Quelques études ont montré que la salinité n'a aucun effet négatif sur le photosystème II (PSII) (MORALES et al.,1992) , alors que récemment d’autres études ont prouvé que la contrainte saline inhibe l'activité du PSII (GHANEM et al.,2008). Bien que la photosynthèse n’est pas toujours ralentie par la salinité mais elle est également stimulée par des basses concentrations en sels dans quelques espèces (KURBAN et al.,1999). La salinité diminue l'assimilation de CO2 par des réductions de surface des feuilles (MUNNS et al.,2000), conductibilité des stomates (PARIDA et al.,2003), et le bon fonctionnement de photosystèmes (REDONDOGOMEZ et al.,2008). • Effets de salinité sur la germination La présence excessive des sels solubles peut causer une forte pression osmotique chez les plantes et l’inhibition de la germination des graines ainsi que le développement de la plante entière en réduisant sa capacité à retenir l’eau entraînant des conséquences sur le niveau de croissance et sur l’activité métabolique (MUNNS,2002 ; BELKHODJA et BIDAI,2004). Plusieurs études ont montré que le sel a un effet dépressif sur le taux de germination, sur la croissance biologique et sur la production des grains (M’BAREK et al.,2001). Cependant, cet effet varie en fonction de l’intensité du stress et de la variété des plantes et cela; soit en en diminuant la quantité d’eau et la vitesse de son absorption par la graine, soit par l’accroissement de la pression osmotique de l’eau d’imbibition qui est trop élevé pour permettre la germination (KATEMBE et al.,1998), ou en augmentant la pénétration d’ions qui peuvent s’accumuler dans la graine à des doses qui deviennent toxiques (DEBEZ et al.,2001). • Effets de salinité sur les racines Les racines sont les premiers organes confrontés à l’augmentation du sel, il a été observé que des concentrations importantes de polypeptides appelés osmotine, s’accumulent dans les plantes au niveau des vacuoles de cellules de tabac soumises à des doses élevées de sel (SINGH et al.,1987). 7 Chapitre I- Synthèse bibliographique • Effet de salinité sur le métabolisme azoté Chez les légumineuses, le métabolisme azoté et la synthèse protéique sont sévèrement affectés par le stress salin, limitant ainsi fortement la productivité et le développement normal des plantes (PESSARAKLI et al.,1989). Cette contrainte provoque aussi la diminution de l’activité de la nitrogénase et d’autres enzymes impliquées dans l’assimilation de l’azote (DELGADO et al.,1993), la salinité peut même affecter la vie microbienne du sol et donc la minéralisation de l’azote. 3- Le stress thermique Le stress thermique correspond à une élévation de la température approximativement de 10°C au dessus de la température normale de croissance (SCHÖFFL et al., 1986). Tout effet négatif ou néfaste du stress thermique sur les membranes conduit à la rupture de l'activité cellulaire ou à la mort (SANTORO et al., 1992). L'élévation de la température provoque une dénaturation des protéines membranaires par la fonte des lipides membranaires qui conduit à la rupture des membranes et à la perte du contenu cellulaire (ABROL et INGRAM, 1997).C'est pour cela, la chaleur demeure un facteur plus néfaste dans les zones sahariennes où les vents chauds et secs (sirocco) desséchants affectent la production de gousse et limitent aussi la production et la grosseur des graines (SANTORO et al., 1992). De plus, la baisse de la température entraîne le ralentissement de la croissance, voir même une destruction des végétaux exposés (BELHASSEN et al., 1995). C'est aussi l'une des contraintes au niveau des plaines intérieures qui explique une grande partie de la faible productivité dans cette zone due à la coulure des fleurs et aussi à la mortalité des plantes (MINISTERE DE L’AGRICULTURE, 1990). 4- Le stress hydrique Le terme "déficit hydrique" ou stress hydrique se rapporte à l'état physiologique de la plante, lorsque les conditions d'eau sont défavorables à la croissance optimum (BLUM, 1974). D'après KOSLOWSKI (1968), le déficit hydrique des plantes résulte d'une combinaison entre la plante, les facteurs du sol et l'atmosphère contrôlant le taux d'absorption de l'eau et les pertes d'eau par transpiration. 8 Chapitre I- Synthèse bibliographique Il y a stress hydrique lorsque la quantité d'eau perdue par transpiration est supérieure à celle que la plante est incapable d'absorber par ses racines (BOUSMAHA et BOULEBENE, 1991). La dessiccation est une perte d’eau plus accentuée qui peut potentiellement conduire à une interruption du métabolisme, une déstructuration cellulaire et éventuellement un arrêt de l’activité enzymatique (SMIRNOFF,1993; MARTRE,1999). Les contraintes hydriques connues sont de deux types ; édaphiques et atmosphériques (MARTRE et al.,2000). Les contraintes édaphiques, qui correspondent à une disponibilité en eau réduite dans le sol (LIANG et al.,2002). En ce qui concerne les contraintes atmosphériques, lorsque la demande évaporatoire augmente, les pertes d’eau par transpiration créent un flux d’eau dans la plante, qui du fait des résistances aux mouvements d’eau dans le sol et la plante, entraînent une altération de l’état hydrique de la plante (MARTRE et al.,2000). 5- Le stress ionique Le stress ionique survient lorsque l'accumulation des sels dans les tissus perturbe l'activité métabolique de la plante (LEVIGNERON et al., 1995). Ce type de stress est lié à la composition en éléments minéraux du sol et les carences en certains ions (MONNEVEUX et THIS, 1997). L'entrée massive de certains ions dans la plante, telle que le sodium et le chlore, exerce une action toxique qui se manifeste par des lésions sur les feuilles (MEKKAOUI, 1990). Il apparaît aussi que la combinaison (Na+, Cl-) entraîne des effets spécifiques que ne peuvent apporter d'autres combinaisons d'anions avec le sodium, de cations majeurs avec le chlore (GUERRIER, 1981). 9 Chapitre I- Synthèse bibliographique II- LA PLANTE : Vicia faba L. 1- Généralités sur la fève a -Description La fève est une plante herbacée robuste de la famille des papilionacés, pouvant dépasser un mètre, a feuilles pennées par une pointe, de folioles larges de couleur glauque. L’inflorescence est en racème de deux à cinq fleurs parfois solitaire, à corolle blanche ou rosée, avec des taches noires sur les ailes. Le fruit est une gousse contenant des graines de formes ovale et aplatie avec une peau épaisse, les fèves, a chromosomes grands et moins nombreux que chez la plupart des espèces dans le genre 2n=2x=12. Cette espèce diffère des autres espèces de Vicia par l’absence de vrilles et par son aspect du hile qui est à l’angle droit de la longueur de la graine (BELKHODJA, 1996). Cette plante est exigeante, la température optimale pour sa croissance est autour de 20C°. Fig.1- Aspect général de Vicia faba L. b -Caractères taxonomiques Classification Règne : Plantae Sous-règne : Tracheobionta Division : Magnoliophyta Classe : Magnoliopsida Sous-classe : Rosidae Ordre : Fabales Famille : Fabaceae Genre : Vicia Espèce : faba 10 Chapitre I- Synthèse bibliographique 2-Origine, répartition géographique et écologie La culture de la fève remonte à la plus haute antiquité. Elle servait aussi de jeton de vote lors des saturnales et c'est là l'origine de la fève de la galette des Rois (BOND, 1988). Elle était connue en Europe, en Égypte et en Arabie. En chine, sa culture remonte à 2800 ans avant l'ère chrétienne (LAWES et al., 1983). Selon LADIZINSKY (1975), la majorité des auteurs considèrent son origine à l'Est et L'Ouest de l'Asie; pour d'autres L'Égypte, l'Éthiopie et l'Afghanistan (ABDALLAH, 1979). En Europe, SCHULTZE-MOTEL (1972) in BELKHODJA (1996) rapporte que la fève remonte à la période du néolithique et qu'elle fut cultivée que vers la fin de cette ère en Espagne, Portugal et l'Est de l'Europe. La fève est localisée dans l'étage bioclimatique de 250 mm de pluie, tolère bien le froid (HERZOG, 1984) et les hautes températures; la somme de températures nécessaires pour accomplir son cycle végétatif varie de 1900 à 2000 °C (CARLU, 1952). La fève préfère les sols profonds, silico-argileux riches en matières nutritives et en humus (KOLEV, 1976). 3-Intérêts économiques La récolte mondiale de fèves s'élève à 4,75 millions de tonnes (FAO, 2002), dont : fèves vertes (1,02 millions de tonnes) et fèves sèches (3,73 millions de tonnes). Les fèves séchées sont toujours une des bases de l’alimentation en Orient et en Afrique du Nord. Elles furent, avant le haricot, le légume du cassoulet. Il faut les faire tremper avant de les cuire. Elles s’accommodent comme les haricots secs. La farine de fève est utilisée dans des recettes régionales. Son ajout, à celles de blé et de seigle, est autorisé à raison de 2 % maximum dans la fabrication du pain. La farine de fève a une saveur prononcée de noisette et une texture onctueuse. Les « févettes » sont cueillies avant maturité. Elles ont une gousse vert-pâle et de petits grains. La fève est une légumineuse riche en protéines végétales, en glucides, en vitamines du groupe B et en vitamine C. Elle l’est également en fibres : quelques fèves croquées en début de repas sont un excellent moyen de lutter contre la constipation. C’est un des légumes bénéfiques du régime méditerranéen. La fève peut être consommée crue, mais sans la peau épaisse qui contient des tannins. En Espagne, elle entre dans la composition du fabada, une sorte de cassoulet. En Italie, on la cuisine alla pancetta, avec des oignons et du lard. Au Moyen-Orient, elle est consommée en purée, en beignets ou en salade. 11 Chapitre I- Synthèse bibliographique Fig.2 - Apport calorifique de 100 g de la fève verte d'Aguadulce (VICTOR le jardinier, 2000). III - La relation symbiotique : légumineuses - rhizobiums Les pressions environnementales telles que la sécheresse et la salinité sont en étroite interaction avec les stresses secondaires comme le stress osmotique et oxydatif. Dans le cas des plantes tolérantes, les processus déclenchés par les premiers signaux impliquent des contrôles de la transcription activant les mécanismes de réponse au stress qui maintiennent ou rétablissent l’homéostasie, facilitent la rétention ou l’accumulation d’eau, protègent le fonctionnement du chloroplaste et l’intégrité de la membrane cellulaire. Chez les légumineuses, comme les stresses abiotiques interagissent avec le système racinaire et les nodules, les relations avec la fixation azotée symbiotique doivent avoir une attention particulière (VINOCUR, 2005). 1- L’azote et la plante a -Cycle de l’azote L'atmosphère constitué de 78 % d'azote en volume et de 75% en masse, est le principal réservoir du cycle de l'azote, mais on le trouve également dans l'atmosphère en très faible quantité, de l'ammoniac (NH3) et des oxydes d'azote (N2O, NO2, NO) qui sont les produits des fumées industrielles, des feux de forêts et des activités volcaniques (SPRENT,1997) et des océans. 12 Chapitre I- Synthès ynthèse bibliographique Les organismes smes vivants, plantes et animaux peuventt aussi auss rejeter de faibles quantités de NH3 dans l'atmosphère l (SLADE,2007).Le NO3- est surtout su le produit de l'oxydation de N2 par O2 ou par l'ozone (O3) sous l'effet dess éclairs écla et les radiations ultraviolets. Les organismes ont besoin be d'azote pour fabriquer leurs tissus, s, leurs leur acides aminés, par exemple. Mais la plupart plupar d'entre eux ne peuvent utiliser l'azotee atmosphérique atm N2 (ou diazote). L'azote, compo omposé essentiel à de nombreux processuss biologiques, biol se retrouve entre autres dans les acides aci aminés constituant les protéines, et dans dan les bases azotées présentes dans l'ADN ADN. Des processus sont nécessaires pour transformer l'azote atmosphérique en une ne forme form assimilable par les organismes (PASRICH SRICHA et FOX 1993). L'azote atmosphér osphérique est fixé par des bactéries présentes tes dans da le sol, telles que Azobacter vinelandii,, grâce gr à une enzyme, la nitrogénase. Celles-ci Cell produisent de l'ammoniaque (NH4OH) à partir de l'azote atmosphérique ett de l'hydrogène l' de l'eau. Certaines de ces bactéri actéries, comme Rhizobium, vivent en symbios mbiose avec des plantes, produisant de l'ammonia moniaque nécessaire aux plantes, en contrepartie epartie des glucides de la plante dans la rhizosphère sphère. L'ammoniaque peut aussi a provenir de la décomposition d'organi 'organismes morts par des bactéries saprophytes sous forme d'ions ammonium (NH4+) (PASRICH RICHA et FOX 1993). Fig.3 – Cycle C de l’azote (Encyclopaedia Britanica,, Inc,1998) Inc,1 13 Chapitre I- Synthèse bibliographique b - Assimilation de l’azote par la plante • Nutrition azotée En plus de son rôle constitutif, la disponibilité du S module celle d’autres éléments et notamment celle de l’N. Les métabolismes azotés et soufrés sont fortement interdépendants. Les plantes maintiendraient un ratio N : S organiques relativement constant. Dans la plupart des espèces végétales et dans leurs différents tissus, ce ratio est habituellement de 15 : 1 (PASRICHA et FOX 1993), reflétant la proportion de ces éléments dans les protéines. • Absorption de l’azote - Systèmes de transport impliqués Chez les végétaux supérieurs, l’absorption du nitrate est, selon une caractérisation physiologique, sous la dépendance de trois ou quatre systèmes de transport qui diffèrent par leur affinité pour le nitrate et par leur caractère constitutif ou inductible (SIDDIQI et al., 1990). Le système à forte affinité HATS (High Affinity Transport System) est responsable de l’absorption à de faibles concentrations en nitrate (quelques dizaines de micromoles par litre) alors que le système à faible affinité LATS (Low Affinity Transport System) intervient à des concentrations élevées de nitrate (de l’ordre des millimoles par litre, SIDDIQI et al., 1990 ; GRIGNON et al., 1997). Le système d’absorption présentant une forte affinité présente une composante inductible et une composante exprimée constitutivement (IHATS et CHATS, respectivement). Par contre, le système de transport fonctionnant à forte concentration présente en général une seule composante constitutive (SIDDIQI et al., 1990 ; GLASS et SIDDIQI, 1995), avec cependant chez le colza, la description d’une composante inductible supplémentaire (CLATS et ILATS), (FAURE-RABASSE et al., 2002). Les transporteurs de nitrate sont codés par deux familles de gènes : les gènes NRT1et NRT2, impliqués respectivement dans le transport à faible et à forte affinité (FORDE, 2000). Chez Arabidopsis thaliana, 52 gènes NRT1 et 7 gènes NRT2 ont été identifiés. Les transporteurs NRT2 sont majoritairement exprimés dans les racines, à l’exception du gène AtNRT2.7 préférentiellement exprimé dans les feuilles (ORSEL et al., 2002). 14 Chapitre I- Synthèse bibliographique Sur les 52 transporteurs NRT1, seuls AtNRT1.1, AtNRT1.2 et AtNRT1.4 ont été caractérisés au niveau physiologiques et confirmés comme protéines contribuant au LATS (HUANG et al.,1999 ;CHIU et al., 2004). -Absorption et assimilation du nitrate par les racines Plusieurs études ont montré l’existence d’interactions entre l’assimilation réductrice du sulfate et celle du nitrate (KOPRIVOVA et al. 2000 ; PROSSER et al. 2001). Ces deux voies d’assimilation s’organisent de façon similaire et sont coordonnées .Une déficience en un élément réprime la voie d’assimilation de l’autre qui s’accumule alors (BARNEY & BUSH 1985). Une déficience en S engendre une inhibition de l’absorption du nitrate et une répression de l’activité de certaines enzymes clés de l’assimilation du nitrate, notamment la nitrate réductase (KOPRIVA & RENNENBERG 2004). Elle induit également une accumulation d’acides aminés pouvant être à l’origine de la rétro-inhibition de l’absorption du nitrate, due à une diminution de la disponibilité en acides aminés soufrés (cystéine et méthionine) nécessaires à la synthèse des protéines (NEUESCHWANDER et al. 1991). La cystéine, produit final de l’assimilation du sulfate apparaît comme le point de rencontre entre les métabolismes N et S. Une diminution de la teneur en cette molécule, due à une déficience en S, a des répercussions sur les deux voies métaboliques. De plus, l’O-acétylsérine (OAS), produit de la voie d’assimilation du nitrate et précurseur nécessaire à la synthèse de la cystéine, exercerait un contrôle positif sur l’absorption et l’assimilation du sulfate en cas de déficiences en S (CLARKSON et al. 1989 ; SMITH et al. 1997). -Régulation de l’absorption du nitrate Bien que l’absorption nette de nitrate soit la résultante de l’influx et de l’efflux de nitrate entre le milieu extérieur et la racine, l’efflux de nitrate est souvent négligé d’un point de vue agronomique; d’autant que l’importance de celui-ci, mineure en condition de culture hydroponique, est en fonction de la teneur élevée des racines en nitrate. L’azote minéral est généralement considéré comme le principal facteur limitant la croissance des plantes et donc les accumulations racinaires de nitrate sont rares pour des végétaux cultivés en plein champ. Aucun efflux de nitrate n’a été mis en évidence chez des plantes cultivées au champ en raison, notamment, des difficultés méthodologiques associées (GOMBERT, 2006). 15 Chapitre I- Synthèse bibliographique L’absorption du nitrate est régulée à la fois par la disponibilité en substrat du milieu et par le statut nutritionnel de la plante. D’après le modèle de BEN ZIONI (1971), les acides organiques issus de la réduction du nitrate dans les parties aériennes exercent un contrôle positif sur l’absorption. La réduction foliaire du nitrate s’accompagne d’une production d’ions hydroxyles induisant la synthèse d‘acides organiques qui seront exportés vers les racines via le phloème en compagnie d’ion potassium. La décarboxylation des acides organiques permettrait alors l’excrétion d’ion carbonate dans le cadre d’un antiport avec un ion nitrate. Dans ce cadre, la réduction foliaire de nitrate favoriserait son absorption racinaire. Ce modèle assez ancien, même s’il ne peut être totalement exclu, n’est pas conforté par les données récentes notamment de biologie moléculaire qui envisagent plutôt un antiport de deux protons pour un ion nitrate (GOMBERT, 2006). • La fixation de l'azote -La fixation industrielle de l'azote On peut produire de l'engrais azoté à partir de l'azote de l'air par la réaction de Haber-Bosh. 500°C 300 Atmosphères 3H2 + N2 2 NH 3 Le dihydrogène est produit à partir de gaz naturel (CH4). L'ammoniac produit peut être utilisé directement ou converti en nitrates (ex. nitrate de sodium NaNO3 ou nitrate d'ammonium NH4NO3). Il faut l'équivalent de 2 à 3 tonnes de pétrole pour produire une tonne d'engrais azoté par le processus Haber-Bosch (le gaz naturel pour fournir l'hydrogène et température et pression élevées nécessaires pour la réaction) (KOPRIVA & RENNENBERG 2004). On produit environ 40 millions de tonnes d'ammoniac par le procédé Haber Bosh par année. C'est environ 1/5 de ce qui est produit par les bactéries fixatrices d'azote sur toute la planète. La moitié de l'engrais ajouté est absorbée par les plantes cultivées. Le reste est absorbé par d'autres plantes ou lessivé (PASRICHA et FOX 1993). Les hauts rendements agricoles qui permettent actuellement de nourrir la population mondiale ne seraient pas possibles sans cette production industrielle d'engrais azoté (SLADE,2007). 16 Chapitre I- Synthèse bibliographique -La fixation biologique de l'azote C'est le processus de la fixation biologique de l'azote qui permet de produire des substances protéiques à partir de l'azote gazeux présent dans l'atmosphère et l'environnement (LESUFFLEUR,2007). C’est une réduction enzymatique de N2 (azote moléculaire) en azote ammoniacal, ou ammoniac (NH3); cette forme de N combiné, appelée intermédiaire-clé, représente la fin de la réaction de fixation et le début de l'incorporation de l'azote fixé dans le squelette carboné (PERRET et al., 2000). Dans le système biologique fixateur de N2 les conditions optimales de la catalyse biologique correspondent à une pression de 0,2 à 1,0 atm de N2 et une température de 30-35°C, alors que les conditions de la catalyse chimique sont très sévères (pression de 250- 1.000 atm de N2 et température de 450°C) (HOWARD et REES, 2000). 2 - Interactions entre les plantes et les micro-organismes du sol Les interactions positives existant entre les plantes et les micro-organismes du sol faisant intervenir les exsudats racinaires concernent essentiellement les symbioses mycorhiziennes, les symbioses avec les bactéries fixatrices d’N et les relations avec les bactéries PGPR, alors que les interactions négatives portent surtout sur la défense des plantes contre les pathogènes (LESUFFLEUR,2007). 17 Chapitre I- Synthèse bibliographique Interactions positives PGPRs, symbiontes Racines Bactéries Bio-contrôle, MVA, endophytes Facilitateurs de croissance Champignon racines Vecteurs pour symbiose Interactions négatives Nématodes Bactéries Composés antibactériens, QS Phytotoxines Composés antifongiques Phytotoxines Allélopathie Herbivore racinaire Champignon racines Composés Nématicides/ Insecticides Fig.4- Représentation schématique des possibles interactions (positives ou négatives) rhizosphériques où les exsudats racinaires jouent un rôle. Les flèches indiquent le sens de l’échange de composés. PGPRs : bactéries activant la croissance des plantes ; MVA :mycorhizes à vésicules et arbuscules ; QS : quorum sensing. D’après BAIS et al., 2006. a- Les symbioses mycorhiziennes Plus de 80 % des plantes terrestres forment des symbioses avec des champignons mycorhiziens, qui leur permettent notamment d’accroître l’absorption des éléments minéraux (FRENZEL et al., 2006). Les associations ectomycorhiziennes concernent essentiellement les arbres, les associations endomycorhiziennes à pelotons concernent presque exclusivement les Ericacées, et les herbacées sont quant à elles colonisées par des associations endomycorhiziennes à arbuscules. 18 Chapitre I- Synthèse bibliographique Certains champignons mycorhiziens ne colonisent qu’un petit nombre de plantes hôtes (MALAJCZUK et al., 1982 ; VANDENKOORNHUYSE et al., 2002, 2003). Mais d’autres champignons sont connus pour coloniser un large panel de plantes hôte (MOLINA ET TRAPPE, 1982). Cela suggère qu’il existe à la fois des composés impliqués dans une reconnaissance générale et des composés impliqués dans une reconnaissance plus spécifique entre les symbiontes. Un large panel de composés a été proposé pour jouer le rôle des signaux favorisant la croissance et la colonisation des champignons. Les composés exsudés par les plantes hôtes stimulent la germination et surtout la croissance des hyphes fongiques (CHABOT et al., 1992 ; NAIR et al., 1991 ; GIOVANNETTI et al., 1993a, b). Le rôle stimulateur de certains flavonoïdes (CHABOT et al., 1992 ; BEL-RHLID et al., 1993) tels que la quercétine ou la rutine (LAGRANGE et al., 2001), et également du CO2 issu de la respiration racinaire (BÉCARD et al., 1992 ; POULIN et al., 1993 ; BALAJI et al., 1995), est maintenant clairement établi (CHABOT et al., 1992). Certaines hormones secrétées soit par le champignon, soit par les racines, modifient également la formation de la symbiose (GOGALA, 1991 ; GAY et al., 1994 ; GEA et al., 1994). Le rôle des lectines qui sont des glycoprotéines extracellulaires impliquées dans les processus de reconnaissance entre les racines des plantes et les micro-organismes telluriques, est recherché depuis longtemps dans la symbiose mycorhizienne mais reste à clarifier (SMITH et READ, 1997 ; FRENZEL et al., 2006). En conséquence de la colonisation par des mycorhizes à arbuscules, il a été montré que l’exsudation racinaire est modifiée qualitativement et quantitativement, à l’image du métabolisme général des racines (SHACHAR-HILL et al., 1995 ; BAGO et al., 2003), dès lors où le champignon est un puits de C considérable (DOUDS et al., 2000 ; GRAHAM, 2000). Une diminution des teneurs en sucres totaux dans les exsudats (OCAMPO et AZCON, 1985 ; MADA et BAGYARAJ, 1993 ; BANSAL et MUKERJI, 1994) et des modifications dans la composition des acides aminés (LAHEURTE et al., 1990 ; MADA et BAGYARAJ, 1993) ont été observées. Une fois colonisées par les champignons, les racines sont capables de réguler une nouvelle colonisation via les exsudats qu’elles libèrent. En effet les exsudats de plantes de concombre (Cucumis sativus L.) non mycorhizées favorisent la croissance des hyphes issus de spores de Gigaspora rosea, alors que les exsudats de plantes déjà mycorhizées ne le font pas (PINIOR et al., 1999). 19 Chapitre I- Synthèse bibliographique Dans les associations mycorhiziennes, la rhizosphère est étendue à la «mycorhizosphère » puisque le compartiment du sol environnant n’est pas seulement sous l’influence des racines qui le colonisent, mais aussi des filaments mycéliens provenant du symbionte fongique. On donne à la zone du sol sous l’influence de la phase externe du champignon mycorhizien le nom d’ « hyphosphère » (JONES et al., 2004). Il a été montré que les exsudats des plantes colonisées par des champignons mycorhiziens à arbuscules peuvent modifier la composition microbienne de la rhizosphère (MEYER et LINDERMAN, 1986 ; CHRISTENSEN et JAKOBSEN, 1993 ; BANSAL et MUKERJI, 1994), en augmentant par exemple l’attraction des bactéries PGPR telles que Azotobacter chroococcum et Pseudomonas fluorescens (SOOD, 2003). b- Les bactéries activant la croissance des plantes (bactéries PGPR) Un certain nombre d’études récentes montrent que certaines bactéries du sol stimulent la croissance des plantes sans pour autant former de symbiose, ce sont les bactéries PGPR. Les mécanismes impliqués ne sont pas clairement élucidés (GRAY et SMITH, 2005). Le premier mécanisme qui a été proposé pour expliquer le gain de croissance de la plante est l’enrichissement de la rhizosphère en N par les bactéries libres fixatrices de l’N atmosphérique. Le second mécanisme proposé est la stimulation du métabolisme hormonal de la plante (STEENHOUDT et VANDERLEYDEN, 2000). Ainsi le genre Azospirillum sécrète des phytohormones telles que l’auxine, des cytokinines et des gibbérellines (STEENHOUDT et VANDERLEYDEN, 2000). Les bactéries pourraient également exploiter les exsudats racinaires pour former ces régulateurs de croissance. Ainsi, JAEGER et al. (1999) ont observé chez l’avoine barbue (Avena barbata L.) une exsudation significative de tryptophane à l’apex racinaire, où la microflore considérée dans cette étude est significativement plus abondante. Cela suggère que ce précurseur de l’auxine pourrait être utilisé par les bactéries pour synthétiser cette hormone et activer la croissance des plantes (BAIS et al., 2006). Certaines rhizobactéries aident également les plantes à se prémunir de maladies causées par des champignons ou des bactéries en produisant des métabolites antifongiques ou antibiotiques ou en formant un biofilm protégeant les racines de l’infection par le pathogène (BAIS et al.,2004). Les interactions biochimiques entre les racines et ces bactéries sont moins spécifiques que celles qui impliquent des symbioses. 20 Chapitre I- Synthèse bibliographique Les exsudats racinaires, et en particulier les sucres et les acides aminés, attirent les bactéries par chimiotactisme à la surface des racines. Ils stimulent notamment la mobilité flagellée de certaines bactéries PGPR comme Pseudomonas fluorescens, ce qui permet à ces dernières de coloniser la rhizosphère (de WEERT et al., 2002). c- Les symbiotes fixateurs d’azote En raison de l’importance économique et environnementale des symbioses fixatrices d’azote, les mécanismes qui initient les premières étapes de la reconnaissance entre les racines des Fabacées et les bactéries du genre Rhizobium, et amènent à la formation de nodules racinaires sont particulièrement étudiés (JAIN et NAINAWATEE, 2002 ; INDERJIT et WESTON, 2003). D’autres symbiotes fixateurs d’N existent (Frankia-Alnus par exemple), mais elles ont été moins étudiées et ne sont pas traitées ici. L’interaction entre les bactéries Rhizobium et les Fabacées est hautement spécifique, dès lors où une souche donnée de Rhizobium est capable de former des nodules chez un nombre réduit de plantes hôtes (GORDON et al., 2001). Les bactéries Rhizobium sont attirées et leur croissance est stimulée par certains composés exsudés par les racines des Fabacées en petites quantités en comparaison des autres composés exsudés (JANCZARECK et al., 1997). Parmi ces composés, on trouve essentiellement des métabolites secondaires et notamment des flavonoïdes (plus de 4000 identifiés), mais aussi des protéines, des glycanes, des acides carboxyliques, des acides aminés et des bétaïnes. Parmi les protéines, un certain nombre de lectines telles que la trifoliine émise par les racines de trèfle a été identifié (DAZZO et al., 1978). Ces composés dans leur ensemble sont reconnus au niveau des bactéries par des protéines de la famille NodD, qui en retour déterminent la synthèse de signaux extracellulaires, les facteurs Nod, libérés dans la rhizosphère (PHILLIPS et TSAI, 1992 ; PERRET et al., 2000). Cette reconnaissance entre un métabolite et une protéine NodD constitue un premier niveau de spécificité (GORDON et al., 2001). Par exemple, la naringénine induit l’expression des gènes nod chez Rhizobium leguminosarum bv. viciae, alors que la daidzéine en est responsable chez Bradyrhizobium japonicum. Cette spécificité n’est pas stricte, car une protéine NodD donnée est généralement capable de reconnaître plusieurs flavonoïdes différents, et la plante exsude un ensemble de différents flavonoïdes. De plus, de nombreuses espèces de Rhizobium possèdent plusieurs protéines Nod D (GORDON et al., 2001). Ces évènements gouvernent les premiers processus associés au phénomène de nodulation chez la plante hôte (MULLIGAN et LONG, 1985 ; SPAINK et al., 1989). 21 Chapitre I- Synthèse bibliographique • La nitrogénase bactérienne La fixation biologique de l’azote atmosphérique est catalysée par un complexe enzymatique appelé complexe nitrogénase (figure 5) (HOWARD et REES, 2000). Cette enzyme a été mise en évidence uniquement chez des procaryotes. Le complexe nitrogénase est très conservé chez les bactéries fixatrices d’azote tant au niveau de sa séquence que de sa structure. Il est constitué de deux métalloprotéines : le site de la réduction du substrat est la protéine MoFe (composant I ou dinitrogénase) et le donneur d’électrons est la protéine Fe (composant II ou dinitrogénase réductase). Le composant I est un hétérotétramère de type α2β2 codé par les gènes nifD et nifK et le composant II est un homodimère codé par le gène nifH ( HOWARD et REES, 2000). La régulation de l’expression de la nitrogénase est complexe ; elle fait intervenir au niveau transcriptionnel d’autres gènes nif de l’opéron (nifA et nifL notamment) et au niveau post-traductionnel un système d’ADPribosylation (répression de l’enzyme par NH4+ et l’obscurité). Le complexe nitrogénase est extrêmement labile en présence de dioxygène (HALBLEIB et LUDDEN, 2000). La réaction catalysée par cette enzyme est la suivante : N2 + 8H+ +8e- + 16ATP →2NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi La réaction de fixation de l’azote est très coûteuse en énergie (ATP et pouvoir réducteur). De ce fait, la fixation de l’azote par les bactéries diazotrophes à l’état libre est peu efficace : de l’ordre de la dizaine de kg N.ha-1.an-1. L’association symbiotique entre des bactéries fixatrices d’azote et certaines plantes permet d’améliorer considérablement cette valeur pour atteindre une centaine de kg N.ha-1.an-1 (BOHLOOL et al., 1992). La symbiose Rhizobium-Légumineuses est la plus étudiée car elle concerne beaucoup d’espèces d’intérêt agronomique (alimentation humaine et animale). Les symbioses actinorhiziennes sont moins étudiées mais ont néanmoins une grande importance écologique. Figure.5- Structure de la nitrogénase d'Azotobacter vinelandii obtenue par diffraction des rayons X. 22 Chapitre I- Synthèse bibliographique La réaction est coûteuse en énergie (figure 6). Elle nécessite 16 ATP pour chaque NH3 produit (c'est la plante qui fournit, sous forme de nourriture, l'énergie à la bactérie). Figure.6- production de l'ammoniac à partir d’azote atmosphérique • Génétique de la Fixation Certaines bactéries fixant l'azote vivent en liberté, mais la plupart des espèces symbiotiques comme le genre Rhizobium vivent au sein de nodosités spécialisées sur les racines de légumineuses. La formation de ces nodosités exige une collaboration génétique intime entre les bactéries et la plante. (MICHELLE et LINDEQUE, 2006). -Les flavonoïdes Ils se trouvent chez les végétaux, où ils interviennent dans la symbiose entre les fabacées et les bactéries du groupe Rhizobium (INDERJIT et WESTON, 2003). Ces exsudats qui sont émis par les cellules des racines de légumineuses vont attirer la bactérie, qui en retour relâche des lipopolysaccharides (LPS) provenant de sa membrane (tableau 1) (PHILIP-HOLLINGSWORTH et al., 1991 ; KIJNE et al., 1997 ; GORDON et al., 2001). Ces LPS ont une structure antigénique spécifique, reconnue par la plante, la bactérie peut lyser la paroi de la cellule végétale et s'y introduire. Il y a formation d'un cordon infectieux, qui se ramifie au fur et à mesure de son passage dans d'autres cellules végétales. Dans le cytoplasme, les bactéries ne sont pas libres, elles sont regroupées dans des vésicules de séquestration. Si la cellule est diploïde, elle se nécrose et meurt. Si elle est tétraploïde en revanche, il y a formation d'un nodule (ELMERICH, 2004). 23 Chapitre I- Synthèse bibliographique Tableau 1- Composés contenus dans les exsudats racinaires des Fabacées qui induisent les gènes nod des bactéries Rhizobium. D’après Dakora et Phillips, 2002. a inhibiteur des gènes nod. Espèce Molécule inductrice Référence (in Dakora et Phillips, 2002) Medicago sativa 4,4’-dihydroxy-2’-methoxychalcone 4’-7-dihydroxyflavone Liquiritigenine Maxwell et al. (1989) Vigna unguiculata Daidzeine Genisteine Coumestrol Dakora (2000) Phaseolus vulgaris Genisteine Genistein-3-O-glucoside Eriodictyol Naringenine Daidzeine Coumestrol Dakora et al. (1993) Hungria et al. (1991) Macrotyloma geocarpum Daidzeine Genisteine Coumestrol Dakora (2000) Glycine max Isoliquiritigenine Genisteine Genistein-7-O-glucoside Genistein-7-O-(6’’-O-malonylglucoside) Daidzeine Daidzein-7-O-(6’’-O-malonylglucoside) Kape et al. (1992) Smit et al. (1992) Vicia sativa 3,5,7,3’-tetrahydroxy-4’-methoxyflavanone 7,3’-dihydroxy-4’-methoxyflavanone 2’,4’,4-trihydroxychalcone 4’4-dihydroxy-2’-methoxychalcone Naringenine Liquiritigenine 7,4’-dihydroxy-3’-methoxyflavanone 5,7,4’-trihydroxy-3’-methoxyflavanone 5,7,4’-trihydroxy-4’-methoxyflavanone Recourt et al. (1991) Trifolium repens 7,4’-dihydroxyflavone a Umbelliferone a Formononetine Djordjevic et al. (1987) Vigna subterranea Daidzeine Genisteine Coumestrol Liquiritigenine Dakora et Muofhe (1996) Acide erythronique Acide tetronique Gagnon et Ibrahim (1998) Sesbania Lupinus Dakora et al. (1993) Messens et al. (1991) 24 Chapitre I- Synthèse bibliographique -Le gène nod D Les flavonoïdes compatibles activent la protéine NodD, qui est un senseur de l’environnement et un activateur des gènes nod. Les protéines NodD synthétisées vont se lier à la nod-box, lieu de régulation des gènes nodA, B et C (GORDON et al., 2001). Avec la coopération des flavonoïdes, les protéines NodD vont pouvoir promouvoir l’expression des gènes nodA, B et C (MULLIGAN et LONG, 1985): les protéines NodD ont un site de liaison pour les flavonoïdes ; une fois les flavonoïdes liées aux protéines NodD, ces dernières, liées à la nod-box, sont capable d’induire la transcription de ces gènes (figure 7) (PHILLIPS et TSAI, 1992 ; PERRET et al., 2000). La polymérase se fixe alors sur le promoteur de ces gènes, ces derniers sont transcrits, et les protéines NodA, B et C sont traduites( HOWARD et REES, 2000). Fabacée hôte Rhizobium Flavonoïdes, Bétaïnes Formation de nodules Facteurs Nod Figure.7- Échange de signaux dans la symbiose Rhizobium-Fabacée. L’état activé de la protéine NodD est indiqué par l’étoile rouge. D’après Gordon et al., 2001. 25 Chapitre I- Synthèse bibliographique -Les gènes nif La transcription des gènes de la fixation de l'azote (gènes nif) n'a lieu que dans des conditions physiologiques bien définies qui dépendent des propriétés des bactéries concernées. Les signaux majeurs intervenant dans cette régulation sont l'ammoniaque et l’oxygène (ELMERICH, 2004). Dans la majorité des cas l'expression des gènes nif dépend d'un activateur de la transcription appelé NifA et d'un facteur sigma spécifique, produit de rpoN, qui reconnaît des promoteurs particuliers en amont des opérons nif. De grandes variations existent, selon les genres bactériens, dans la régulation de la transcription et de la traduction de nifA, ainsi que dans les mécanismes de modification post-traductionnelle de NifA. Les recherches portent sur deux systèmes d'intérêt agronomique : l'un concerne une association symbiotique « vraie » entre une légumineuse et Azorhizobium caulinodans, l'autre concerne la biologie des bactéries du genre Azospirillum, qui s'associe aux céréales. A. caulinodans forme des nodosités fixatrices d'azote à la fois sur les racines et sur les tiges de la légumineuse tropicale Sesbania rostrata, et fixe également l'azote dans les conditions non-symbiotiques. Chez Azospirillum brasilense, on a montré que NifA est exprimé en présence d'ions ammonium et d'oxygène (DUPUY et NOUGIER, 2005), conditions incompatibles avec la fixation de l'azote. Ceci laisse supposer que NifA peut exister sous deux formes, active et inactive, et que l'activité de NifA est régulée de manière post-traductionnelle. Les nouveaux travaux réalisés ont permis de mettre en évidence que la cible du contrôle par l'ammoniaque correspond à la partie N-terminale de NifA et que la protéine PII, produit du gène glnB, joue un rôle dans cette régulation. Les études génétiques et biochimiques visant à caractériser le gène glnB et son produit, PII, ont aboutit à la caractérisation d'un second gène, appelé glnZ, très homologue à glnB. L'inactivation de chacun des deux gènes ainsi que la construction de doubles mutants, a permis de montrer que seul glnB est essentiel pour la fixation de l'azote. La caractérisation du gène glnB a été également effectuée chez A. caulinodans (ELMERICH, 2004). Les études ont permis de montrer que ce gène n'est pas requis pour la fixation de l'azote à l'état libre tandis qu'il est essentiel pendant la symbiose avec la plante hôte. Chez A. caulinodans on a poursuivi l'étude du rôle d'une protéine affine de l'ARN, NrfA dans le contrôle de la fixation de l'azote. Les travaux en cours visent à élucider comment NrfA contrôle l'expression de nifA et à quel niveau s'exerce le contrôle par NrfA et par l'ammoniaque. Les travaux sur la colonisation des racines de blé par Azospirillum ont été continués. 26 Chapitre I- Synthèse bibliographique Les bactéries à la surface de la racine présentent une morphologie ressemblant à des cystes, une forme de différenciation observée également à l'état libre. L'étude d'un mutant qui reste sous la forme végétative en association avec la plante a permis d'identifier un gène de régulation qui contrôle le processus de différenciation et de colonisation des racines (ELMERICH, 2004 ; DUPUY et NOUGIER, 2005). • Les rhizobiums -Définition et intérêt Rhizobium signifie étymologiquement « ce qui vit dans les racines » ce genre a été crée en 1889 par Frank pour les bactéries qui peuvent infecter les racines des légumineuses (MAZLIAK, 1981). L’infection se traduit par la formation d’un organe nouveau appelé nodule, dans lesquelles, elles vivent comme endosymbiotes, et réduisent l’azote atmosphérique en ammoniaque (ALBRECHT et al., 1999), forme facilement assimilable par les plantes. En échange la plante hôte procure à la bactérie un microhabitat exceptionnellement favorable et les substrats carbonés issus de la photosynthèse (DOMMERGUE et al., 1999). Dans ce contexte l’association rhizobium-légumineuse peut remplacer efficacement les engrais azotés chimiques à la fois très coûteux et polluants (CANADIAN, 1993). -Principales caractéristiques Ces microorganismes se présentent en cocciforme ou en bâtonnets réguliers de 0.6 à 0.8µm de large sur 1 à 4 µm de long (DOMMERGUES et MANGENOT, 1970) appartiennent à la famille des Rhizobiacea, strictement aérobies (PELMONT,1993), Gram négatives et asporulales (BEKKI,1983 ; JORDAN,1984). Généralement très mobiles quand elles sont jeunes grâce à leurs flagelles péritriches (1à 6) ou subpolaires (BERGEY’S,1984).ils peuvent exister à l’état libre et hétérotrophe dans le sol, ou à l’état de microsymbiote dans les nodosités des légumineuses (VINCENT,1970). Dans ce dernier cas, les bactéries changent de morphologie et le terme bactéroîde leur a été attribué, afin de différencier des Rhizobiums à l’état libre (BERGEY’S,1984). Les rhizobiums sont des bactéries mésophiles, leurs températures optimale de croissance se situe entre 25 et 30C° (ELKAN,1992). Certaines espèces peuvent se développer à des températures allant de 40.5C° à 42C°. c’est le cas de Rhizobium meliloti qui peut se développer à 42.5C° (AFFIANA et ALEXANDER,1992). 27 Chapitre I- Synthèse bibliographique Si la plupart des Rhizobiums préfèrent la neutralité (JORDAN ,1984), d’autres au contraire tolèrent un pH très bas (VINCENT,1970 ; BERGEY’S,1984).c’est le cas de Bradyrhizobium japonicum qui supporte des pH de l’ordre de 3.5à 4( DOMMERGUES et MANGENOT,1970). Sur milieu gélosé YMA (Yeast/Mannitol/Agar), ces bactéries forment des colonies de 2à4mm de diamétre après une incubation de 3 à 5 jours, de couleurs blanchâtres ou beiges, circulaires, convexes, semi-translucides ou opaques et mucilagineuses. La croissance sur milieu carboné est souvent accompagnée de production massive d’exopolysaccharides (BEKKI et al.,1987 ;BAHRI,1997 ; et ZAHRAN et al.,1994). Sur milieu liquide la turbidité est visible, au bout de 2 à 3 jours d’incubation sous agitation (DE LAJUDIE et al.,1998 et YOUNG et al.,2001). La plupart des rhizobiums sont des chimioorganotrophes, capable de métaboliser une large gamme de carbohydrates tel que le glucose, l’arabinose, le fructose, le galactose et le sucrose comme métabolites carbonés (VINCENT et al., 1970), toute fois le mannitol reste la source la plus utilisée (GRAHAM, 1969). Pour combler leur incapacité à fixer l’azote atmosphérique, il es essentiel d’additionner à leur milieu de culture des nitrates qui sont réduits en nitrites, sels d’ammonium et les plus favorables étant les peptones. Ils peuvent également utiliser la majorité des acides aminés connus (GOURRET et LE RUDULIER,1985). -La taxonomie des rhizobiums La classification des Rhizobiums a subi de nombreux remaniements ces dernières années. Dans la huitième édition de Bergey’s un seul genre Rhizobium était décrit et les différentes espèces ont été crées selon le concept de groupe d’inoculation croisée. Cette notion de groupe d’inoculation était fondée sur le caractère d’infectivité des souches c'est-à-dire de leur aptitude à pénétrer dans la racine ou la tige de la légumineuse et y induire la formation d’un nodule. Plus tard vint s’ajouter le critère d’efficience ou aptitude à fixer l’azote, il a été démontré qu’une souche efficiente vis-à-vis du Medicago sativa présentait une spécificité d’hôte plus étroite que ne le faisait une souche non efficiente visà-vis de la même plante hôte.de même BROCKWELLE et HELY (1966) pensaient que le critère efficience pourrait servir de fondement à une classification présentant un intérêt pratique indiscutable. En 1982 JORDAN, classa les bactéries symbiotiques fixatrices de l’azote en deux genres Rhizobium et Bradyrhizobium selon leur vitesse de croissance : 28 Chapitre I- Synthèse bibliographique • Le genre Rhizobium regroupait les espèces à croissance rapide dont le temps de génération est de 4h. • Le genre de Bradyrhizobium regroupait les espèces à croissance lente et présentant un temps de génération supérieur à 6h (tableau 2). Tableau 2 - Taxonomie des rhizobia selon leur vitesse de croissance (JORDAN, 1982) Bactérie à croissance rapide Bactérie à croissance lente Rhizobium leguminosarum Bradyrhizobium japonicum Rhizobium meliloti Rhizobium loti Quand à la classification précédente basée sur la spécificité d’hôte, elle a été complètement abandonnée après que BREWIN et al., (1980) et PRAKASH et al., (1981) aient démontré que chez ces bactéries les fonctions symbiotiques sont pour une grande partie codées au niveau des plasmides symbiotiques pSym souvent conjugatifs. Ceci explique la présence chez une même légumineuse des Rhizobiums génétiquement très distants (SCHOLLA et ELKAN, 1984). Ainsi, tous les spécialistes dans ce domaine s’accordent à ce qu’il est nécessaire que la taxonomie des Rhizobiums réponde aux mêmes critères que ceux retenus pour la taxonomie des autres bactéries à savoir, les caractéristiques morphologiques et culturelles, l’homologie ADN/ARN, %G+C, et le profil éléctrophorétique des protéines. C’est ainsi que GRAHAM et al., (1991) proposent des critères standards minimaux requis pour modifier la taxonomie des Rhizobiums qui comprennent à la fois des données phylogénétiques et phénotypiques. Grâce à cette approche la taxonomie compte actuellement plus de 48 espèces de Bactéries Nodulant les Légumineuses « BNL », réparties en 11 genres (tableau 3). 29 Chapitre I- Synthèse bibliographique Tableau 3 - Taxonomie actuelle des bactéries nodulant les légumineuses Genre Rhizobium Mesorhizobium Sinorhizobium Genre et espèces Rhizobium etli Rhizobium galegae Rhizobium gallicum Rhizobium giardinii Rhizobium hainaneuse Rhizobium hautleuse Rhizobium indigofere Rhizobium leguminosarum Rhizobium loessense Rhizobium lupini Rhizobium mongolense Rhizobium sullae Rhizobium tropici Rhizobium undicola Rhizobium yanglingense Mesorhizobium amorphae Mesorhizobium chacoense Mesorhizobium ciceri Mesorhizobium huakuii Mesorhizobium loti Mesorhizobium mediterraneum Mesorhizobium plurifarium Mesorhizobium septentrionale Mesorhizobium temperatum Mesorhizobium tianshanese Sinorhizobium americanus Sinorhizobium arboris Sinorhizobium fredii Sinorhizobium kostiens Sinorhizobium kummerowiae Sinorhizobium medicae Sinorhizobium meliloti Sinorhizobium morelens Sinorhizobium saheli Sinorhizobium terangae Sinorhizobium xinjiangense Référence FRANK, 1889 JARVIS et al.,1997 CHEN et al.,1988 30 Chapitre I- Synthèse bibliographique Bradyrhizobium Bradyrhizobium elkanii Bradyrhizobium japonicum Bradyrhizobium liaoningens Bradyrhizobium yuanmingens Bradyrhizobium canariens JORDAN, 1982 Azorhizobium Azorhizobium caulinodans DREYFUS et al.,1988 Allorhizobium Allorhizobium undicola de LAJUDIE et al.,1998a Methylobacterium Methylobacterium nodulans SY et al.,2000 Burkholderia Burkholderia tubern Burkholderia phymatum MOULIN et al.,2001 et VANDAMME et al.,2002 Ralstonia Ralstonia taiwanesis CHEN et al.,2001, CHEN et al.,2003 Devosia Devosia neptunia RIVAS et al.,2003 Blastobacter Blastobacter denitrificans VAN BERKUM et EARDLY, 2002 • Mécanisme de la nodulation -Formation des bactéroïde L'envahissement des bactéries dans des cellules de la plante hôte est débuté par la formation d'une gouttelette d'infection. Les gouttelettes d'infection peuvent former au bout des fils intracellulaires courts d'infection (par exemple dans haricots de Phaseolus ou, plus habituellement, aux positions dans l'infection filète où la paroi des cellules devient abrupte et les cellules bactériennes entrent en contact direct avec la membrane de plasma de centre-cellule. Les bactéroïdes mûrs de membrane de cellules de la plante continuent à accumuler de grandes quantités de PHB polyhydroxybutyrate (JUERGEN PRELL et al., 2006). 31 Chapitre I- Synthèse bibliographique -Les étapes de la nodulation Préinfection L’interaction entre la plante et la bactérie débute dans la rhizosphère, la croissance des bactéries se fait de manière sélective par la plante (SAVKA et al., 2002). Les rhizobia sont attirés vers les poils racinaires par une large gamme de substances de type flavonoïdes et isoflavonoïdes, principalement par les phénylpropanoïdes exsudés par la racine. Une production plus importante de ces composés est observée en condition de carence azotée . Les flavonoïdes présents dans les exsudats racinaires induisent l’expression des gènes nod bactériens qui gouvernent lipochitooligosaccharides (PERRET et al., la production des facteurs Nod, des 2000). Les facteurs Nod induisent des événements morphologiques, physiologiques et moléculaires chez la plante hôte ; la déformation du poil racinaire est observée environ 12 à 24 heures (figure 8) (Patriarca et al.,2004) ; les poils absorbants changent leur direction de croissance et forment une structure en crosse de berger, courbés, renflés, entrelacés, déformés, branchés ou joints qui enferme les Rhizobium (WEI et al., 2002). Elle fait intervenir des changements dans l’arrangement des microtubules; plus précisément, les poils racinaires peuvent adopter différentes formes en fonction de leur stade de développement (TIMMERS et al., 1999) . Figure.8- Déformation des poils racinaires chez le haricot Différents types de déformation des poils racinaires sont observés chez le haricot (Phaseolus vulgaris) après contact avec la bactérie Rhizobium etli. Gauche : différentes zones correspondant aux différents stades de différenciation des poils racinaires. Droite : types de déformations couramment observées en réponse à la bactérie symbiotique (Patriarca et al.,2004). 32 Chapitre I- Synthèse bibliographique L’infection L’infection des racines peut avoir lieu à travers les poils absorbants ou des blessures, ou à travers l’espace intercellulaire (RASANEN, 2002). Au cours de l’infection, la pénétration de la bactérie est facilitée par la courbure du poil racinaire et par conséquent la bactérie est entourée par la paroi végétale dans une zone confinée. La croissance des nodosités se poursuit dans les régions infectées de l'écorce et du péricycle, jusqu'à ce que ces deux masses de cellules fusionnent et forment la nodosité. Développement du nodule L’infection de la plante par les rhizobia induit la dédifférenciation et la division des cellules du cortex (FOUCHER et KONDOROSI, 2000). Les nodules de type indéterminé (Medicago truncatula, Pisum sativum) sont formés à partir du cortex interne alors que les nodules de type déterminé ( Glycine max, Phaseolus vulgaris) sont formés à partir du cortex externe. La persistance du méristème chez les espèces à nodules de type déterminé est très éphémère et la croissance en longueur du nodule est limitée. Une croissance en épaisseur a lieu par hypertrophie des cellules corticales et par des divisions de cellules contenant déjà des rhizobia. Ce processus de formation se traduit par une forme sphérique et un état de différenciation identique pour toutes les cellules. Dans le cas des espèces à nodules de type indéterminé, la zone méristématique est persistante ce qui se traduit par une forme allongée. Dans les deux cas, les cellules du cortex se divisent de manière anticline puis péricline (TIMMERS et al., 1999). Toutes les cellules du cortex ne se divisent pas, ce qui semble indiquer que la susceptibilité de ces cellules pourraient être liées à un statut particulier, notamment une modification de la concentration en hormones (MATHESIUS et al., 2000a). De manière concomitante, les cellules voisines développent des cordons de préinfection, constitués de ponts cytoplasmiques alignés de façon radiale (VANEECHOUTTE et al.,2004). Ces structures guident la croissance des cordons d’infection en direction du primordium nodulaire en formation (figure 9). L’utilisation d’inhibiteurs du transport d’efflux d’auxine entraîne la formation de «pseudonodules » (FANG et HIRSCH, 1998) suggérant un rôle de l’auxine dans la formation du nodule. De plus, les facteurs Nod produits par Rhizobium avant l’infection entraînent une modification de la balance hormonale de la plante. 33 Chapitre I- Synthèse bibliographique Les mécanismes moléculaires responsables de ces changements sont inconnus mais il semble que les facteurs Nod agissent sur les flux d’auxine à deux niveaux : une inhibition du transport de l’auxine (MATHESIUS et al., 1998) et l’induction de la synthèse de flavonoïdes (MATHESIUS et al., 2000a). Les flavonoïdes sont susceptibles de provoquer l’accumulation de l’auxine en réduisant son oxydation de manière directe (substrats de l’enzyme) ou indirecte (en réagissant avec H2O2 ; MATHESIUS, 2000a). Leur rôle dans l’inhibition du transport de l’auxine est également supposé. Des travaux récents montrent que l’extinction par la technique d’ARN interférent de l’expression du gène de la chalcone synthase (CHS) chez M. truncatula entraine une augmentation du transport de l’auxine associée à une inhibition de la nodulation (WASSON et al., 2006). Figure.9- Infection intracellulaire et différenciation du Symbiosome chez les Légumineuses Les bactéries sont déversées dans la cellule végétale par fusion des vésicules lipidiques avec l’extrémité du cordon d’infection. La différenciation en bactéroïdes commence alors. EPB, espace péribactéroïdien ; MS, membrane du symbiosome ; RE, réticulum endoplasmique. D’après Patriarca et col, 2004. 34 Chapitre I- Synthèse bibliographique Figure.10- Développement des nodules sur les racines dans un cas de symbiose entre Rhizobium et une plante (Perry et al., 2004). - Structure du nodule L’infection du nodule indéterminé se fait par sa base, ce qui établit un gradient de différenciation et définit plusieurs zones (figure10) (Perry et al., 2004): la zone méristématique (zone I) située à l’apex. Cette zone est toujours dépourvue de bactéries. 35 Chapitre I- Synthèse bibliographique la zone de préfixation (zone II) qui contient les cellules corticales nouvellement produites par le méristème et qui sont envahies par des cordons d’infection rhizobiens. Les bactéries sont déversées dans les cellules (FANG et HIRSCH, 1998), entourées par la membrane péribactéroïdienne, et leur différenciation en bactéroïdes commence. À ce stade, elles ne fixent pas encore l’azote. L’interzone II-III dans laquelle la différenciation des bactéroïdes se poursuit et la fixation de l’azote commence. Cette zone se caractérise par la présence de nombreux amyloplastes. La zone de fixation (zone III) où les bactéroïdes pleinement différenciés fixent activement l’azote. La zone de sénescence (zone IV) qui est présente chez les nodules âgés. Les nodules de Légumineuses présentent une structure similaire à celle d’une tige avec les tissus vasculaires périphériques qui se raccordent à ceux de la racine et une zone centrale infectée par les Rhizobia(VANEECHOUTTE et al.,2004). De la périphérie vers l’intérieur du nodule, on trouve : le cortex externe constitué en majorité par des cellules parenchymateuses le cortex moyen les tissus vasculaires constitués surtout de phloème et entourés par un endoderme et un péricycle le cortex interne formé de une à trois couches de cellules le parenchyme central qui contient les cellules infectées par les rhizobia et des cellules non infectées. • Tolérance et effet de la salinité sur la croissance des rhizobiums En général, les rhizobiums sont reconnus comme peut tolérant à la salinité. La tolérance au sel (ou halotolérance) des rhizobiums est très variable et dépend probablement dans une grande mesure, de l’efficacité de leurs mécanismes d’osmorégulation (BRAHADA et LE RUDULIER, 1994). Cette sensibilité varie considérablement d’une souche à une autre et s’exprime non seulement dans un même groupe mais également chez les souches isolées d’une même plante ( BEKKI, 1983). 36 Chapitre I- Synthèse bibliographique La salinité affecte leur croissance et leur multiplication, mais différemment suivant l’espèce (RAI, 1983 ; HAMAD et ALZAIAT, 1989). De nombreux rhizobiums sont inhibés par des concentrations de 100 mM NaCl (SINGLETON et al, 1982) ; mais certaines souches comme R. fredii, R. tropici peuvent supporter plus de 300 mM (ELSHEIKH et WOOD, 1990), particulièrement R meliloti est très résistante (LE RUDULIER et al, 1983). Une augmentation de la concentration saline provoque une baisse de l’activité respiratoire du bactéroïde avec un ralentissement de l’activité photosynthétique et de la synthèse des protéines, elle entraine l’inhibition de la nitrogénase par les altérations au niveau membranaire et donc la mortalité de la bactérie (GOURRET et RUDILIER, 1985). La salinité peut aussi induire des modifications du contenu protéique chez les rhizobiums (SOUSSI et al, 2001). Elle affecte également la synthèse des lipopolysaccharides (LPS) essentielles à l’initiation de la nodulation (LIORET et al, 1995). • L’osmorégulation chez les rhizobiums Les microorganismes, en particulier les bactéries Gram négatifs peuvent répondre au stress hydrique provoqué par une augmentation de la concentration saline de leur environnement par une modification de leur pression osmotique (BEKKI, 1986 ; ABDELMOUMEN et al, 1999). Cette adaptation osmotique est connue sous le nom d’osmorégulation (LE RUDULIER et BERNARD, 1986). Pour ce défendre cette perturbation osmotique, un certain nombre d’activités de transports et de métabolismes sont déclenchés chez la bactérie pour ajuster sa pression osmotique. Dans un premier temps, les bactéries résistantes stimulent le transport des ions potassium qui vont s’accumuler dans la cellule bactérienne. Le rôle des ions K+ n’est que transitoire, ils permettent l’élévation de la pression osmotique intracellulaire permettant ainsi l’expression de systèmes impliqués dans le transport de vrais osmoprotecteurs : la glycine betaine et la choline (SMITH et al, 1988 ; BARHADA et LE RUDULIER, 1994). 37 Chapitre II- matériel et méthodes CHAPITRE II- MATERIEL ET METHODES I- MATERIEL 1 - la plante Le matériel végétal retenu dans cette étude concerne une légumineuse, la fève (Vicia faba L.) ; variété locale provenant de la station de l’ITGC de Sidi Bel Abbés. 2 - la bactérie A partir de chaque lot de nodules racinaires prélevés sur des plantes de Vicia faba L. récoltés à Ain El turck nous avons effectué un réisolement des rhizobiums présents dans les nodules. II - METHODES 1- Préparation des graines Notre expérience est menée dans une serre du laboratoire de Physiologie Végétale à l’université d’Oran en conditions contrôlées (température, humidité, luminosité). 80 graines de Vicia faba L. sont sélectionnées rigoureusement en fonction de leur morphologie, leur taille, leur couleur et leur état sanitaire. Les graines de Vicia faba L. sont d’abord désinfectées dans l’eau de javel durant 05mn puis rincées à l’eau distillée pendant 1mn. Ces graines sont semées dans des alvéoles ne contenant que du terreau puis sont arrosées à l’eau distillée (pendant 10 jours). Après germination des graines, les plantules sont repiquées dans des pots. Fig. 1- Plantules de Vicia faba L. cultivées en alvéoles 38 Chapitre II- matériel et méthodes La culture est réalisée dans des pots en plastique d’une capacité de 2.5kg, d’un diamètre de 20 cm et d’une hauteur de 22 cm, dont le fond est tapissé avec du gravier afin d’assurer le drainage. 2- Préparation du substrat de culture Le sable utilisé dans la préparation du substrat est récupéré du bord de la plage à El Macta; située à 60 Km à l'Est d'Oran. Ce substrat présente l'avantage de se comporter comme un élément neutre par rapport à la terre. Ce sable a subi plusieurs préparations pour son utilisation selon les étapes suivantes: • Différents types de tamis sont utilisés afin d'éliminer les débris végétaux, animaux et gravier pour n'obtenir que du sable fin. • Ce sable est lavé plusieurs fois à l'eau de robinet dans le but d'éliminer les sels. • Le sable est ensuite épandu dans la serre, sur du papier journal pour subir une phase de séchage complet. • Après séchage, ce sable est lavé à l'esprit de sel pour éliminer les sulfates, carbonates,…etc. • Puis des rinçages répétés à l'eau déminéralisée pour éliminer le chlore. • Un test confirmatif de la désalinisation du sable est réalisé par le nitrate d’argent. • Le sable est ensuite épandu à l'air libre, sur une couche de papier journal pour subir un séchage naturel. Ainsi préparé, le sable constitue un support inerte à la plante, aère les racines et présente l'avantage de ne pas fixer les ions (DEMOLON, 1968). Des pots en plastique sont remplis d'un substrat composé d'un mélange sableterreau (1 volume terreau + 2 volumes sable). Cette valeur de poids est retenue pour déterminer la capacité de rétention du substrat : cette caractéristique hydrique est nécessaire car elle permet le calcul des quantités de solution nutritive à apporter lors des arrosages, et est fonction de la nature du substrat, de son poids dans le pot et de l'âge de la plante (BELKHODJA, 1996). Après la prégermination, les plantules sont repiquées soigneusement à raison d’une plantule par pot et irriguées à 60% de la capacité de rétention du substrat soit environ 125 ml de solution nutritive par pot déterminées après le calcul de leur capacité de rétention. 39 Chapitre II- matériel et méthodes Fig. 2- Dispositif expérimental L’arrosage est fait trois fois par semaine à l’eau distillée substituée une fois sur trois par une solution nutritive de Hoagland (1938) diluée au 1/1000éme couramment utilisée au laboratoire ; cet apport est conçu pour éviter l’épuisement des éléments nutritifs et l’accumulation de sels dans le substrat de culture par évaporation de l’eau jusqu’à l’obtention d’un matériel végétal suffisant pour faire les analyses. Les pots sont répartis en huit traitements salins desquels nous avons utilisé les chlorures de sodium (NaCl) seuls et combinés avec les chlorures de calcium (NaCl+CaCl2) et l’eau de mer à différentes concentrations dans la solution d’irrigation. Chaque traitement comporte dix pots à raison de dix répétitions. • Un premier traitement est irrigué à l’eau distillée substituée une fois sur trois par une solution nutritive de type Hoagland(1938). • Deux traitements subissent un ajout de 50meq.l-1 et 200meq. l-1 des chlorures de sodium dans l’eau d’arrosage afin d’apprécier le seuil de toxicité de ces deux éléments dans la plante expérimentée. • Dans les deux autres traitements, les sels additionnés à l’eau d’irrigation à des doses croissantes sous forme de NaCl+CaCl2 à raison de 50meq.l-1 et 200meq. l-1 , l’usage de ce type de sels dans cette composition s’impose en raison du rôle physiologique du calcium chez les végétaux dans la régulation de la croissance et du développement (KREIMER et al.,1985) et du métabolisme des plantes (KREIMER et al.,1988). En outre le NaCl au CaCl2 produit un milieu salin (LESAOS, 1978) alors que la solution, avec seulement du NaCl, est plutôt sodique (HOFFMAN et al., 1989 ; BELKHODJA,1996). 40 Chapitre II- matériel et méthodes • Trois traitements subissent un ajout d’eau de mer à raison de 25%, 50% et 100% dans l’eau d’arrosage. L’application des solutions salines décrites ci-dessus est procédée une fois sur les plantes en expérience au stade florale, les prélèvements et les analyses sont faits sur la partie aérienne et la partie racinaire une semaine après l’exécution du stress. 3- Solutions nutritive et saline La solution nutritive utilisée est celle de Hoagland (tableau 1). Tableau 1- Composition minérale de la solution nutritive Poids en g.l-1 Composants Macroéléments Nitrate de potassium (KNO3) Nítrate de calcium(NO3)2 Ca 4H2O) Nitrate d'ammonium (NO3 NH4) Sulfate de magnesium (SO4 Mg 7H2O) Phosphate monopotassique (PO4 H2 K) Di-potassium hydrogénophosphate (PO4 K2 H 3H2O) 191.9 129.8 210 61.5 54.4 34.23 Oligoéléments Chlorure de manganèse (Cl2 Mn 4H2O) Sulfate de cuivre (Cu SO4 5H2O) Sulfate de zinc (Zn SO4 7H2O) Acide borique (H3 BO3) Molybdate d'ammonium (MO7 O24 (NH4) 7H2O) Complexe ferrique EDTA (C10H12FeN2NaO8) 1.8 0.176 0.219 2.861 0.285 0.05 Les solutions salines sont obtenues par l’addition de NaCl (Chlorure de sodium) et de CaCl2 (Chlorure de calcium) à la solution nutritive, dont les proportions indiquées au tableau 2. Tableau 2 - Composition de la solution saline NaCl g.l-1 CaCl2 g.l-1 Témoin 0 0 50 meq.l-1 2.92 2.77 200 meq.l-1 11,7 11,1 4- Récolte et conservation des nodules Les nodules sont récoltés à partir de Vicia faba L. provenant d’un terrain agricole bordé à droite par l’autoroute menant au Cap Falcon et Ain El Turck et conservés dans des tubes à essai contenant du glycérol à 60% à 4 C°. 41 Chapitre II- matériel et méthodes Fig. 3- Conservation des nodules 5- Inoculation par les rhizobiums Nous avons effectué un réisolement des rhizobiums présents dans les nodules récoltés à Ain El Turck, pour cela les nodules ont été écrasés dans de l’eau distillée stérile. Les souches de rhizobium sont cultivées dans le milieu YEM à 28°C pendant 5jours (la méthode d’isolement est expliquée si dessous), l’inoculation des plantes est effectuée au moment de la mise en place des jeunes semis, elle consiste à verser sur la zone du collet 500µl de la culture bactérienne âgée de 5 jours. 6- Isolement et conservation des souches de rhizobium Le milieu Yeast Extract Mannitol (YEM) dont la composition est indiquée en annexe est utilisé pour l’obtention des souches de Rhizobium. L’isolement des souches de Rhizobium est effectué en conditions stériles selon la technique de Weaver et Frederick (1982) : les nodules racinaires prélevés sur des plantes de Vicia faba L. sont lavés à l'eau courante pour enlever toute trace de terre. Chaque nodule, lavé superficiellement à l'eau, trempé dans de l’alcool 70% pendant 5 min, rincé plusieurs fois avec l’eau distillée stérile, puis trempé dans une solution de chlorure mercurique à 0.1% pendant 3 min. Après plusieurs rinçages à l’eau distillée stérile, chaque nodule est sectionné transversalement. Une portion de la zone centrale rouge indiquant la présence de leghémoglobine est soigneusement prélevée et déposée dans une boîte de Pétri contenant du milieu YEM gélosé (ou bien dans un tube à essai contenant du milieu YEM liquide). A partir de chaque dépôt, des stries d’épuisement sont effectuées de façon à avoir, au bout de 3 à 5 jours d’incubation à 28C°, des colonies bien isolées. Chaque isolat obtenu est purifié par des repiquages successifs à partir d’une colonie bien isolée. 42 Chapitre II- matériel et méthodes 7- Identification a - Morphologie Il est essentiel de distinguer la forme des bactéries isolées, l’examen de préparation microscopique révélé par la coloration de Gram permet de faire cette distinction. Réalisation du frottis • Disposer sur une lame propre une goutte d’eau stérile puis incorporer à l’aide d’une ance stérile une colonie ou seulement une parcelle de culture, dilacérer soigneusement. • Réaliser le frottis en partant du centre de la lame en décrivant un mouvement circulaire. • Stériliser l’ance. • Sécher et fixer le frottis au-dessus de la flamme du bec bunsen. • Réaliser un frottis et le fixer. • Recouvrir la lame de violet de gentiane durant une minute. • Laver à l’eau distillée. • Recouvrir la lame d’une solution de lugol pendant 30 secondes. • Laver à l’eau distillée. • Recouvrir la lame d’éthanol durant 10 secondes. • Laver rapidement et recouvrir la lame de fushine ; pendant 10 secondes. • Laver à l’eau distillée. Au microscope optique les bactéries Gram positif apparaissent violettes, les bactéries Gram négatif sont roses. 8 - Paramètres mesurés Au stade floraison, 10 plantes par traitement sont récoltées manuellement et séparées en parties aériennes, racines et nodules. 43 Chapitre II- matériel et méthodes Fig. 4- Stade floraison de Vicia faba L. a- Nombre de nodules par plante Les racines après être séparées de la partie aérienne, sont soigneusement lavées puis déposées dans un récipient en verre rempli d’eau, qui nous facilite le comptage manuel des nodules. b- Détermination du poids sec Les racines sont rapidement rincées à l’eau puis essorées avec du papier filtre. Les nodules sont détachés de leurs racines, les masses de matière sèche des différents organes de la plante sont déterminées par pesée après dessiccation à l’étuve à 80 °C pendant 72 h. c- Dosage de l’azote total Cent mg de matière sèche finement broyée de la partie aérienne de la plante est utilisés pour le dosage d’azote par la méthode de Kjeldahl. Les analyses de variance et les erreurs standards des moyennes ont été réalisées pour déterminer la signification (p < 0,05) des différences entre les traitements. Fig. 5- Préparation du broyat végétal 44 Chapitre II- matériel et méthodes Principe L’échantillon est minéralisé en milieu acide sulfurique en présence de cuivre et d’un catalyseur (sélénium ou mieux oxyde de titane moins dangereux pour l’environnement). Dans les conditions de minéralisation, l’azote organique est retrouvé sous forme ammonium. Les ions ammonium sont transformés en ammoniac par passage en milieu alcalin. On entraîne NH3 à la vapeur d’eau et on dose le condensât recueilli par dosage volumétrique acide/base. Minéralisation de type Kjeldahl classique (en milieu acide sulfurique) La minéralisation est conduite à ébullition douce en milieu acide sulfurique chargé de sulfate de potassium et en présence de catalyseurs (les plus employés sont le sélénium ou le dioxyde de titane sous forme cristalline anatase mélangés à du sulfate de cuivre. Ces conditions de minéralisation conduisent à : - l’azote organique et (évidemment) les formes NH4+ sont retrouvées sous forme NH4+, NO2- et NO3- ne sont que partiellement réduits en NH4+. Leur réduction totale implique un traitement préalable supplémentaire en milieu acide en présence des réducteurs acide salicylique et thiosulfate de sodium ; -le carbone organique est retrouvé sous forme de carbone (noir) puis CO2. -l'hydrogène et l'oxygène sont combinés en H2O. Au cours de la minéralisation, l'acide sulfurique se décompose partiellement en dioxyde et trioxyde de soufre (SO2 et SO3, gaz toxiques irritants). Il y a ainsi apparition de vapeurs blanchâtres très irritantes. La minéralisation est donc conduite avec un appareillage à aspiration puis traitement des vapeurs avant rejet. • Alcalinisation du milieu minéralisé et entraînement à la vapeur de l’ammoniac formé NH4+ + OH- NH3 + H2O L'ammoniac (volatil) ainsi formé est entraîné par de la vapeur d'eau (hydrodistillation), les vapeurs, condensées par réfrigération, sont recueillies dans un milieu suffisamment acide. 45 Chapitre II- matériel et méthodes Remarque : le minéralisât est un milieu acide sulfurique concentré. Il est donc nécessaire d'introduire suffisamment de soude pour neutraliser puis alcaliniser et transformer NH4+en NH3. On peut vérifier que le milieu est bien alcalin en ajoutant quelques gouttes de phénolphtaléine à la soude. • Dosage de l'ammoniac recueilli Cas du dosage indirect (ou en retour) L'ammoniac est recueilli dans une quantité connue (via la réalisation d’un témoin) et en excès d’une solution d'un acide fort. La fin de l’entraînement de NH3 est estimée en considérant le volume de distillat recueilli ou la durée de l'opération. Le reliquat de protons (du à l’excès d’acide fort) est dosé par une solution titrée d’une base forte. L’indicateur coloré de fin de dosage est le rouge de méthyle qui vire à la goutte près à la fin du dosage du reliquat de protons. Ce type de dosage évite tout risque de pertes en ammoniac distillé (SPRENT,1988). d- Conductivité électrique du sol Le niveau de salinité d’un sol est caractérisé par la conductivité électrique (CE) d’un extrait de pâte saturée. La mesure de la CE est réalisée à l’aide d’un conductivimètre. La conductivité électrique correspond au mouvement de particules chargées à travers un matériau sous l’action d’un champ électrique. La conductance du liquide créant le contact entre les deux cellules est directement proportionnelle à la quantité de sels en solution et définit la CE de la solution (1mmhos.cm-1 = 1ds.m-1). (KARLA et MAYNARD ,1992 ; BRADY et WEIL, 2002 ; ESSINGTON, 2004). À partir du sol où on a isolé les souches de rhizobiums utilisées, on prend un échantillon de terre fine • Faire sécher l’échantillon de terre à l’air libre. • Tamiser à travers un tamis d’un diamètre inferieur à 2mm. • On utilisera un rapport 1/5 : dans un bécher 10g de terre tamiser sera dilué dans 50ml d’eau distillée. • Réchauffer la solution sur plaque chauffante plus agitation avec un barreau magnétique pour obtenir un liquide plus homogène. • Filtrer la solution à travers un papier filtre. • Passer à la lecture sur conductivimètre. 46 Chapitre II- matériel et méthodes Fig. 6- Agitation et filtration de la solution de terre. 9- Analyse statistique Le traitement statistique est effectué à l’aide du logiciel SPSS, dont les données obtenues sont soumises à une analyse de la variance ; avec une espèce (Vicia faba L.) et un nombre de blocs égal à sept traitements salins et un témoin. L’analyse statistique est exécutée en utilisant le test de Fisher suivie par une analyse de corrélation afin de mettre en évidence les relations existant entre les différents paramètres étudiés. Les valeurs sont mentionnées dans le tableau par leur moyenne plus au moins leur écart type pour les huit échantillons de chaque traitement. 47 Chapitre III- Résultats CHAPITRE III- RESULTATS I – Variations du poids sec des plantes selon les différents stress salin 1 – Partie aérienne • Traitement au NaCl A l’échelle des plantes issues du traitement témoin, le poids sec de la partie aérienne (tiges+feuilles) de la fève est de 5.06g, la solution d’arrosage mélangée au NaCl n’a pas affecté significativement le poids sec de la partie aérienne (fig. 1). 6 PS (g/plante) 5 4 3 2 1 0 Témoin 50 meq 200 meq NaCl Fig.1- Poids sec (g/plante) mesuré après une semaine de stress au NaCl dans la partie aérienne de Vicia faba L. âgée de six semaines. En effet, à une concentration de 50 meq.l-1 de NaCl, le poids sec diminue de 7.3% comparé à celui du témoin tandis que ce taux de réduction arrive à 14.2% lorsque les plantes reçoivent la salinité à 200 meq.l-1. Tableau 1- Test statistique de signification de Fisher (P= 5%) du poids sec (g/plante) des parties aériennes (tiges+feuilles) de Vicia faba L. âgée de six semaines, stressées au NaCl à l’aide du logiciel SPSS. Poids sec (g/plante) - Témoin 5.06 ± 0.24 50 meq.l-1 4.69 ± 0.41 NS 200 meq.l-1 4.34± 0.77 NS Les valeurs écrites dans les cases des tableaux sont représentées par les moyennes statistiques des données associées à leurs écarts type. - NS : Effet non significatif de la salinité sur le paramètre étudié. Le test de Fisher (tableau 1) ne nous montre aucune variation significative des poids secs des plantes sous stress salin par rapport aux plantes nourries seulement à la solution nutritive. 48 Chapitre III- Résultats • Traitement au NaCl+CaCl2 La figure 2 indique que l’apport de CaCl2 au NaCl à 50 meq.l-1 fait chuter le poids sec de la partie aérienne de 20% si l’on se réfère au poids sec des plantes témoins (4.05 contre 5.06 g/plante). Dès que les plantes sont stressées à 200 meq.l-1 de NaCl+CaCl2, le poids sec de la partie aérienne augmente de nouveau variant jusqu’à 4.39 g/plante. 6 PS (g/plante) 5 4 3 2 1 0 Témoin 50 meq 200 meq NaCl + CaCl2 Fig.2- Poids sec (g/plante) mesuré après une semaine de stress au NaCl+ CaCl2 dans la partie aérienne de Vicia faba L. âgée de six semaines. L’analyse statistique conclut que les poids secs des parties aériennes des plantes cultivées sous contrainte saline quelle que soit la concentration présentent des valeurs significatives comparativement au témoin (tableau 2). Tableau 2- Test statistique de signification de Fisher (P= 5%) du poids sec (g/plante) des parties aériennes (tiges+feuilles) de Vicia faba L. âgée de six semaines, stressées au NaCl+ CaCl2. Poids sec (g/plante) Témoin 50 meq.l-1 200 meq.l-1 5.06 ± 0.24 4.05 ± 0.18 S 4.39 ± 0.46 S • Traitement à l’eau de mer Les plantes conduites sous salinité à l’eau de mer répondent différemment par rapport à celles traitées soit au NaCl ou aux NaCl+CaCl2. En effet, la figure 3 montre clairement que le poids sec déterminé pour la partie aérienne des plantes témoins a atteint une valeur de 5.06 g/plante ; sous le traitement à l’eau de mer, le poids sec baisse progressivement pour 49 Chapitre III- Résultats les plantes arrosées à la solution saline au fur et à mesure que le milieu devienne plus concentré. Ainsi, le poids sec enregistré pour le témoin passe de 4.46 g/plante pour les plantes cultivées à l’eau de mer à 25% pour arriver à 4.33 g/plante pour celles arrosées à 50% de dilution ; l’eau de mer utilisée sans dilution (100%) réduit le poids à 4.13 g/plante. 6 PS (g/plante) 5 4 3 2 1 0 Témoin 25% 50% 100% Eau de mer Fig.3- Poids sec (g/plante) mesuré après une semaine de stress à l'eau de mer dans la partie aérienne de Vicia fabaL. âgée de six semaines. Ces variations du poids sec de la partie aérienne indiquent que l’effet salinité affecte significativement (P< 0.001) à la baisse ce paramètre par rapport au poids sec des plantes (tableau 3). Tableau 3- Test statistique de signification de Fisher (P= 5%) du poids sec (g/plante) des parties aériennes (tiges+feuilles) de Vicia faba L. âgée de six semaines, stressées à l'eau de mer. Témoin Poids sec (g/plante) 5.06 ± 0.24 25% 4.46 ± 0.36 S 50% 4.33 ± 0.54 S 100% 4.13 ± 0.50 S 2 – Partie racinaire • Traitement au NaCl L’examen de la figure 4 montre qu’il y a une augmentation notable significative du poids sec des racines de la fève au fur et à mesure que le milieu se concentre en NaCl. 50 Chapitre III- Résultats Le poids sec varie de1.59 g pour les racines des plantes témoin à 2.67 et 2.74 g respectivement pour les mêmes organes des plantes conduites sous les salinités à 50 et 200 PS (g/plante) meq.l-1 ce qui donne un taux d’augmentation respectif de 68% et 72.3%. 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Témoin 50 meq 200 meq NaCl Fig.4- Poids sec (g/plante) mesuré après une semaine de stress au NaCl dans les racines de Vicia faba L. âgée de six semaines. Les valeurs enregistrées des poids sec des racines indiquent un effet significatif de la salinité quelle que soit la concentration du milieu ce qui est indiqué au tableau 4. Tableau 4- Test statistique de signification de Fisher (P= 5%) du poids sec (g/plante) des racines de Vicia faba L. âgée de six semaines, stressée au NaCl. Témoin Poids sec (g/plante) 1.59 ± 0.30 50 meq.l-1 200 meq.l-1 2.67 ± 0.50 S 2.74 ± 0.55 S • Traitement au NaCl+CaCl2 Pour les plantes nourries au NaCl+CaCl2, les poids secs subissent une nette variation puisqu’il augmente de valeur pour les racines stressées à 50 meq.l-1 puis une baisse de la valeur de ce paramètre s’observe pour les racines traitées à la concentration de 200 meq.l-1. 51 Chapitre III- Résultats Ainsi le tableau 5 montre que le poids sec des racines des plantes témoins passe de 1.59 g/ plante pour augmenter significativement (P< 0.001) vers 2.41 g/plante, ce qui PS ( g/plante) représente un taux de 51.5% lorsque les plantes sont comparé au témoin. 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Témoin 50 meq 200 meq NaCl +CaCl2 Fig.5- Poids sec (g/plante) mesuré après une semaine de stress au NaCl+ CaCl2 dans les racines de Vicia faba L. âgée de six semaines. La chute du poids sec enregistrée chez les racines des plantes soumises à 200 meq.l-1 ne semble pas subir d’effet du NaCl+CaCl2 comparativement au témoin, alors que le taux de réduction exprime une valeur de 64.3% en référence au poids sec signalé pour les racines des plantes traitées à 50 meq.l-1 de NaCl+CaCl2 du poids sec racinaire (fig.5). Tableau 5- Test statistique de signification de Fisher (P= 5%) du poids sec (g/plante) des racines de Vicia faba L. âgée de six semaines, stressée au NaCl+ CaCl2. Témoin Poids sec (g/plante) 1.59 ± 0.30 50 meq.l-1 200 meq.l-1 2.41 ± 0.52 S 1.55 ± 0.36 NS Pour une concentration de 200 meq.l-1 L’analyse statistique (tableau 5) n’exprime aucune variation significative. • Traitement à l’eau de mer L’apport d’une concentration de 25% d’eau de mer a augmenté considérablement le poids sec racinaire (fig.6) pour atteindre un niveau significativement élevé (P< 0.01) de 34% (2.13g/plante) par rapport à celui enregistré chez les plantes témoins (1.59g/plante). 52 Chapitre III- Résultats Chez les plantes stressées à la concentration de 50% d’eau de mer, une augmentation significative du poids sec racinaire de 25.1% (1.99g/plante) est relevée comparé au témoin. 3 PS (g/plante) 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Témoin 25% 50% 100% Eau de mer Fig.6- Poids sec (g/plante) mesuré après une semaine de stress à l'eau de mer des racines de Vicia fabaL. âgée de six semaines. Les plantes recevant l’eau de mer non diluée (100%) réagissent sensiblement puisque leur poids sec ne représente qu’une légère augmentation restant par rapport au traitement témoin (fig.6). Mais il faut toutefois signaler que la baisse du poids sec notée successivement sous les traitements à concentration modérée (eau de mer diluée à 50%) et à salinité élevée (100% d’eau de mer) varie de 6.5% à 10.7% si l’on se rapporte aux plantes stressées à faible salinité (25% d’eau de mer). Tableau 6- Test statistique de signification de Fisher (P= 5%) du poids sec (g/plante) des racines de Vicia faba L. âgée de six semaines, stressée à l’eau de mer. Poids sec (g/plante) Témoin 25% 1.59 ± 0.30 2.13 ± 0.26 S 50% 1.99 ± 0.26 S 100% 1.90 ± 0.41NS 53 Chapitre III- Résultats II- Dénombrement des nodules des plantes sous différents stress salin • Traitement au NaCl La figure 7 indique que le nombre de nodules au niveau des racines des plantes témoins arrive jusqu’à 205.8 nodules/plantes ; l’effectif en nodules subit une nette progression significative équivalente à un taux de 136% (soit 485.5 nodules/plante) à l’ajout de la solution saline de 50 meq.l-1 de NaCl. Tandis qu’a 200 meq.l-1de NaCl, le nombre de nodules par plante marque un taux de progression significatif de 92.5% (soit 396.2 nodules/plante) par rapport au traitement témoin. 600 nodules/plante 500 400 300 200 100 0 Témoin 50 meq 200 meq NaCl Fig.7- Nombre de nodules (nodules/plante) après une semaine de stress au NaCl dans les racines de Vicia fabaL. âgée de six semaines. Il convient de signaler qu’une nette diminution du nombre de nodules par plante est enregistrée pour les plantes soumises aux traitements salins à salinité modérée (50 meq.l-1 de NaCl) et sous forte salinité (200 meq.l-1). Tableau 7- Test statistique de signification de Fisher (P= 5%) des Nombre de nodules (nodules/plante) dans les racines de Vicia fabaL. âgée de six semaines. stressée au NaCl. Témoin Nombre de nodules (nodules/plante) 205.8 ± 40.1 50 meq.l-1 200 meq.l-1 485.5 ± 48.4 S 396.2 ± 69.8 S 54 Chapitre III- Résultats L’analyse de la variance révèle l’existence d’une différence hautement significative pour le nombre de nodules par plante (P < 0.001) sous l’effet de la salinité quelle que soit la concentration (tableau 7). • Traitement au NaCl+CaCl2 L’addition du milieu par le NaCl +CaCl2 à 50 meq.l-1 (figure 8), a amélioré significativement (P < 0.001) l’effectif en nodules jusqu'à 151.6% (517.8 nodules/plante) par rapport au témoin (205.8 nodules/plante), tandis qu’a 200 meq.l-1 de NaCl +CaCl2 une chute non significative est enregistrée du nombre de nodules par plante de 19.6%(165.4 nodules/plante) toujours comparée au traitement témoin. 600 nodules/plante 500 400 300 200 100 0 Témoin 50 meq 200 meq NaCl+CaCl2 Fig.8- Nombre de nodules (nodules/plante) après une semaine de stress au NaCl +CaCl2 dans les racines de Vicia fabaL. âgée de six semaines. Alors que le taux de réduction exprime une valeur de 68% en référence au nombre de nodule signalé pour les racines des plantes traitées à 50 meq.l-1 de NaCl+CaCl2 . Tableau 8- Test statistique de signification de Fisher (P= 5%) du nombre de nodules /plante) des racines de Vicia faba L. âgée de six semaines. stressée au NaCl + CaCl2 Témoin Nombre de nodules (nodules/plante) 205.8 ± 40.1 50 meq.l-1 200 meq.l-1 517.8 ± 47.8 S 165.4± 59.3 NS 55 Chapitre III- Résultats • Traitement à l’eau de mer Les plantes croissant sous stress salin à l’eau de mer, réagissent différemment à ce type de stress. En effet, l’eau de mer a provoqué une diminution notable du nombre de nodules par plante par rapport au traitement témoin (205.8 nodules/plante) quelle que soit le niveau de dilution du milieu. Cette réduction de l’effectif en nodules affiche un taux de 138.9% (138.9 nodules/plante) sous le traitement à 25% de dilution ; cet effectif nodulaire augmente sensiblement jusqu’à un taux de 33.1% pour les plantes stressées à 50% d’eau de mer (soit 185 nodules/plante) puis il accuse une légère chute sous la salinité à 100% d’eau de mer (soit 163.6 nodules/plante) (fig.9). 300 nodules/plantes 250 200 150 100 50 0 Témoin 25% 50% 100% Eau de mer Fig.9- Nombre de nodules (nodules/plante) après une semaine de stress à l’eau de mer dans les racines de Vicia fabaL. âgée de six semaines. L’étude statistique (tableau 9) ne repère aucune différence significative du nombre de nodules par plante (P > 0.05). Tableau 9- Test statistique de signification de Fisher (P= 5%) du nombre de nodules /plante) dans les racines de Vicia fabaL. âgée de six semaines. stressée à l’eau de mer. Témoin Nombre de nodules 205.8 ± 40.1 25% 138.9 ± 41NS 50% 185 ± 57.3 NS 100% 163.6 ± 31.7 NS (nodules/plante) 56 Chapitre III- Résultats III- Dosage de l’azote total de la partie aérienne des plantes sous stress salin • Traitement au NaCl Les variations de la teneur en azote total de la partie aérienne de la fève sont représentées en fonction des traitements salins à la figure 10.Par comparaison avec celle du traitement témoin (672 mg.kg⁻1 PS). L’accumulation d’azote dans les parties aériennes est légèrement ralentie ce qui représente un taux de réduction de 7.1% (624 mg.kg⁻1 PS) en réponse à l’application de la Teneurs en azote total (mg.kg⁻¹PS) salinité à 50 meq.l-1 de NaCl. 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 Témoin 50 meq 200 meq NaCl Fig.10- Teneurs en azote total (mg.kg⁻1PS) après une semaine de stress au NaCl dans la partie aérienne de Vicia fabaL. âgée de six semaines. En revanche, une baisse plus marquée et hautement significative (P < 0.001) du niveau d’accumulation de l'azote de 45% (369 mg.kg⁻1PS) est notée lorsque la concentration en NaCl augmente à 200 meq.l-1 comparée au traitement témoin, tandis qu’elle est de 41% par rapport au stress salin à 50 meq.l-1. Tableau 10- Test statistique de signification de Fisher (P= 5%) de la teneur en azote total (mg.kg⁻1PS) de Vicia fabaL. âgée de six semaines. stressée au NaCl. Témoin Teneurs en azote total (mg.kg⁻1PS) 672 ± 101 50 meq.l-1 200 meq.l-1 624 ± 119.9 NS 369 ± 51.5 S 57 Chapitre III- Résultats Le test de Fisher ne nous montre aucune variation significative parmi la fluctuation envisagée de la teneur en azote total de la partie aérienne de la fève du lot qui a subi un stress au NaCl à 50 meq.l-1 (tableau 10). • Traitement au NaCl+CaCl2 L’examen de la figure 11 révèle que les teneurs en azote total des parties aériennes sont fortement tributaires de l’apport d’une solution saline ; l’application du NaCl+ CaCl2 à 50 meq.l-1 provoque une chute hautement significative (P< 0.001) de la teneur en azote Teneurs en azote total (mg.kg‾¹PS) de 46.4% comparé au témoin (360 contre 672 mg.kg⁻1PS). 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 Témoin 50 meq 200 meq NaCl+CaCl2 Fig.11- Teneurs en azote total (mg.kg⁻1PS) après une semaine de stress au NaCl+ CaCl2dans la partie aérienne de Vicia fabaL. âgée de six semaines. Les parties aériennes demeurent plus riches en azote sous le NaCl+ CaCl2 à 200 meq.l-1 et leur teneur reprend à peu près une valeur équivalente à celle du témoin (671.2 pour 672 mg.kg⁻1 PS). Tableau 11- Test statistique de signification de Fisher (P= 5%) de la teneur en azote total (mg.kg⁻1PS) de Vicia fabaL. âgée de six semaines. stressée au NaCl+ CaCl2. Témoin Teneurs en azote total (mg.kg⁻1PS) 672 ± 101 50 meq.l-1 200 meq.l-1 360 ± 60.4 S 671.2 ± 127.1 NS 58 Chapitre III- Résultats La comparaison des valeurs moyennes du traitement salin à 200 meq.l-1 avec celles du témoin par le test paramétrique de Fisher ne nous montre aucune variation significative du lot de plantes traitées au NaCl + CaCl2 à 200 meq.l-1 (tableau 11). • Traitement à l’eau de mer Nos résultats ont montré que, par comparaison avec le traitement témoin, l’addition du milieu à l’eau de mer à différentes concentrations a entrainé une baisse significative (P< 0.001) des teneurs en azote dans les parties aériennes. En effet à une concentration de 25%, les quantités d’azote accumulées représentent environ 52.8% (317 mg.kg⁻1PS) par rapport à celles des plantes témoins (317 pour 672 mg.kg⁻1PS). Le traitement à 50% d’eau de mer entraine également une chute (302.8 mg.kg⁻1.PS) significative de la teneur en azote des Teneurs en azote total (mg.kg⁻¹PS) parties aériennes de 55% (fig.12) toujours comparé aux plantes témoins. 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 Témoin 25% 50% 100% Eau de mer Fig.12- Teneurs en azote total (mg.kg⁻1PS) après une semaine de stress à l’eau de mer dans la partie aérienne de Vicia fabaL. âgée de six semaines. L’arrosage à 100% d’eau de mer entraîne toujours une diminution significative (P< 0.001) de la teneur en azote dans les parties aériennes ce qui équivaut à un taux de 36% par rapport au traitement témoin. Par comparaison aux deux traitements salins précédents, l’application de ce stress a conduit à une accumulation supplémentaire de l’azote dans les parties aériennes pour atteindre des taux respectifs de 26.3% et 29.8%. Tableau 12- Test statistique de signification de Fisher (P= 5%) de la teneur en azote total (mg.kg⁻1Ps) de Vicia fabaL. âgée de six semaines. stressée à l’eau de mer. Témoin Teneurs en azote total 672 ± 101 (mg.kg⁻1Ps) 25% 317 ± 69.7 S 50% 302.8 ± 75 S 100% 430.6± 100 S 59 Chapitre III- Résultats IV- Variations des ratios 1 – Ratio partie aérienne (tiges et feuilles)/partie racinaire du Poids sec • Traitement au NaCl La figure 13 montre que le stress salin au NaCl n’a pas le même effet sur le poids sec dans les différentes parties de la plante. 3,5 Ratio du PS (g/Plante) 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Témoin 50 meq 200 meq NaCl Fig.13- Ratios partie aérienne (tiges et feuilles)/partie racinaire du poids sec(g) après une semaine de stress au NaCl de Vicia faba L. âgée de six semaines. En effet, les résultats montrent que le rapport de la partie aérienne (tiges et feuilles)/partie racinaire du poids sec(g) de Vicia faba L. diminue d’une manière très prononcée chez les plantes conduites à 50 meq.l-1 et à 200 meq.l-1 successivement, soit un taux de chute d’un niveau d’environ 50 % si l’on se réfère au ratio établis pour les plantes témoins ( ratio de 3,18 contre 1,75 et 1,58 respectivement pour les plantes stressées à 50 et 200 meq.l-1 de NaCl). La diminution du ratio partie aérienne (tiges et feuilles)/partie racinaire du poids sec de la fève correspond à un poids sec beaucoup plus important dans la partie racinaire que aérienne. 60 Chapitre III- Résultats • Traitement au NaCl+CaCl2 L’apport des deux sels dans le milieu fait ressortir un rapport partie aérienne (tiges et feuilles)/partie racinaire pour le poids sec qui tend à une diminution avec l’augmentation de la concentration saline du milieu (fig. 14). Ratio du PS (g/Plante) 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Témoin 50 meq 200 meq NaCl +CaCl2 Fig.14- Ratios partie aérienne (tiges et feuilles)/partie racinaire du poids sec(g) après une semaine de stress au NaCl+CaCl2 de Vicia faba L. âgée de six semaines. Sous NaCl+CaCl2 le ratio partie aérienne (tiges et feuilles)/partie racinaire du poids sec chez les plantes témoins est de 3.18 ; ce ratio chute de 47.1% (soit 1.68) chez les plantes qui reçoivent la solution saline à 50 meq.l-1. Tandis qu’à 200 meq.l-1 il augmente par rapport au traitement précédent (50meq.l-1) de 68.4% mais demeure toujours faible par rapport au ratio des plantes témoins (3.18 contre 2.83). • Traitement à l’eau de mer Sous ce traitement, le ratio poids sec de la partie aérienne (tiges et feuilles)/partie racinaire baisse de 34.2% chez les plantes nourries à 25% d’eau de mer par rapport au témoin. La valeur de ce ratio chute jusqu’à 31.7% pour les plantes soumises à la l’eau de mer aux concentrations de 50% et 100% comparativement au témoin (ratio de 3,18 contre 2.09 et 2.17 respectivement pour les plantes stressées à 25 ,50 et 100 %) (fig. 15). 61 Chapitre III- Résultats Il faut toutefois noter qu’une légère augmentation du ratio de 3.8% ce produit chez les plantes irriguées à 50% et 100% d’eau de mer lorsque les valeurs des ratios sont comparées à celle du traitement à 25 % d’eau de mer. Ces résultats montrent qu’il y a une tendance du ratio vers l’unitèce qui correspond à un poids sec assez équilibré entre la partie aérienne et racinaire. 3,5 Ratio du PS (g/Plante) 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Témoin 25% 50% 100% Eau de Mer Fig.15- Ratios partie aérienne (tiges et feuilles)/partie racinaire du poids sec(g) après une semaine de stress à l’eau de mer de Vicia faba L. âgée de six semaines. 2 – Ratios nombre de nodules / teneurs en azote total • Traitement au NaCl Les plantes sous stress salin à 50 meq.l-1 présentent un ratio nombre de nodules / teneurs en azote total (fig.16) assez élevé (0.77) par rapport aux plantes témoins qui affichent un ratio de (0.3). Chez les plantes nourries à 200 meq.l-1 de NaCl. Une augmentation notable du ratio de 256.6% est observée comparativement au ratio des plantes témoins. 62 Chapitre III- Résultats Les résultats obtenus affichent une augmentation de l’effectif de nodules alors qu’une diminution de la quantité d’azote total se manifeste dans la partie aérienne. Ratio Nodules/Azote 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Témoin 50 meq 200 meq NaCl Fig.16- Ratios nombre de nodules / teneurs en azote total après une semaine de stress au NaCl de Vicia faba L. âgée de six semaines. • Traitement au NaCl+CaCl2 Les résultats dégagés pour ce paramètre (fig.17) montrent que l’apport de ces deux sels se solde d’une vacillation du ratio nombre de nodules / teneurs en azote total chez la plante. Cette valeur présente des fluctuations importantes à travers les différentes concentrations salines testées. En effet les plantes sous stress salin 50 meq.l-1 présentent un ratio nombre de nodules / teneurs en azote total élevé de 376.6% soit 1.43 comparativement au ratio des plantes témoins (0.3).Tandis que celles irriguées par une solution saline de 200 meq.l-1 une baisse de 20% (0.24) est enregistrée par rapport au traitement témoin. Le ratio nombre de nodules / teneurs en azote total de la fève manifeste un comportement distinct entre les deux traitements salins bien qu’il s’amplifie pour une concentration de 50 meq.l-1 décrivant une augmentation du nombre de nodules contre une chute de la teneur en azote total de la partie aérienne de la plante. 63 Chapitre III- Résultats Ce ratio tend a diminué sous l’effet du NaCl+CaCl2 à 200 meq.l-1, ceci résulte vraisemblablement à une diminution de l’effectif de nodules alors qu’une augmentation Ratio Nodules/Azote de la quantité d’azote total se manifeste dans la partie aérienne. 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Témoin 50 meq 200 meq NaCl+CaCl2 Fig.17- Ratios nombre de nodules / teneurs en azote total après une semaine de stress au NaCl+CaCl2 de Vicia faba L. âgée de six semaines. • Traitement à l’eau de mer L’examen de la figure 18 montre que le ratio nombre de nodules / teneurs en azote total de la fève augmente d’une manière très prononcée chez les plantes conduites à 25% et 50% successivement, soit un taux de progression respectivement de 43.3% et 103.3% (ratio de 0.3 contre 0.43 et 0.61) comparativement au ratio des plantes témoins. Tandis qu’il se rétablit presque au même niveau du traitement témoin à une concentration de 100% d’eau de mer (0.37). Ratio Nodules/Azote 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Témoin 25% 50% 100% Eau de Mer Fig.18- Ratios nombre de nodules / teneurs en azote total après une semaine de stress à l’eau de mer de Vicia faba L. âgée de six semaines. 64 Chapitre III- Résultats Ces résultats se traduisent par une augmentation du nombre de nodules contre une chute de la teneur en azote total de la partie aérienne de la fève pour une concentration de 50% d’eau de mer, alors que pour les concentrations de 25% et 100% une augmentation de la teneur en azote total de la partie aérienne de la fève est enregistrée contre une diminution de l’effectif nodulaires. 3 – Ratios nombre de nodules / poids sec de la partie racinaire • Traitement au NaCl Les variations des ratios nombre de nodules / poids sec de la partie racinaire, en Ratio Nodules/PS Racines fonction des traitements au NaCl, sont représentées sur la figure 19. 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Témoin 50 meq NaCl 200 meq Fig.19- Ratios nombre de nodules / poids sec de la partie racinaire après une semaine de stress au NaCl de Vicia fabaL. âgée de six semaines. Il apparait, d’une part, Par comparaison avec le traitement témoin (129.43), le traitement au NaCl à 50 meq.l-1 entraine une augmentation du ratio nombre de nodules / poids sec de la partie racinaire d’un taux de 40.4% (181.83), d’autre part le traitement au NaCl à 200 meq.l-1 provoque une allocation de 11.7% (144.59), soit une chute de 20.4% du ratio en comparant les deux traitements salins. On retiendra, une amélioration de la biomasse racinaire ainsi que la production nodulaire est observée en réponse au stress salin. • Traitement au NaCl+CaCl2 Pour les plantes témoin, le ratio nombre de nodules / poids sec de la partie racinaire est de 129.43 ; ce ratio augmente considérablement à 214.23 lorsque les plantes reçoivent la solution saline à 50 meq.l-1. Une sensible baisse de ce poids est enregistrée (106.7) dés que la concentration en sel augmente à 200 meq.l-1 (fig.20). 65 Chapitre III- Résultats Il ya un équilibre entre le nombre de nodules et le poids sec racinaire, il y a une tendance du ratio vers l’unitèce qui correspond à une réponse similaire au stress salin appliqué. Ratio Nodules/PS Racines 250 200 150 100 50 0 Témoin 50 meq 200 meq NaCl+CaCl2 Fig.20- Ratios nombre de nodules / poids sec de la partie racinaire après une semaine de stress au NaCl+CaCl2 de Vicia faba L. âgée de six semaines. • Traitement à l’eau de mer Les plantes agissent différemment à l’application de ce stress provoquant une diminution notable du ratio par rapport au traitement témoin (129.43). 140 Ratio Nodules/PS Racines 120 100 80 60 40 20 0 Témoin 25% 50% 100% Eau de Mer Fig.21- Ratios nombre de nodules / poids sec de la partie racinaire après une semaine de stress à l’eau de mer de Vicia faba L. âgée de six semaines. 66 Chapitre III- Résultats La comparaison entre les différentes concentrations utilisées fait ressortir une nette fluctuation des valeurs des ratios obtenues. Ainsi, une chute des ratios est enregistrée variant de 49.6% à 28.1% et 33.4% soit 129.43 contre 65.21, 92.96 et 86.1 (fig.21) pour les plantes traitées respectivement à 25%, 50% et 100% d’eau de mer. Ces résultats se traduisent par une diminution du nombre de nodules contre une augmentation du poids sec des racines de la plante pour une concentration de 25% d’eau de mer.Alors que pour les concentrations de 50% et 100% une diminution de la biomasse sèche racinaire est enregistrée contre une augmentation de l’effectif nodulaire. V- Isolement et purification des souches de rhizobiums 1- Examen macroscopique Les colonies obtenues après isolement et purification des différentes souches sur milieu YEM présentent des caractéristiques macroscopiques communes. Elles apparaissent homogènes le long des stries, elles sont circulaires de 2 à 3 mm de diamètre, de couleur blanchâtre, compactes pour la plupart, opaques, de surface lisse et visqueuse à contour régulier. 2- Examen microscopique L’observation microscopique des souches après coloration de Gram montre que nos isolats présentent une forme coccobacilles, plus au moins isolées de couleur rose, ce qui montre que ces des Gram négatif. Fig. 22- Aspect macroscopique des souches de Rhizobiums sp. Sur milieu YEM après 48h d’incubation à 28°C. Les souches de rhizobiums utilisées ont été isolées à partir d’un sol à conductivité de 0.64 mmhos/cm (peu salé selon l’échelle de salinité). 67 Discussion et conclusion générales DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALES La nutrition azotée des légumineuses est d’autant plus difficile à étudier qu’elle résulte de la combinaison de deux voies très différentes, la fixation de l’azote atmosphérique et l’assimilation de l’azote minéral (PROSSER et al. 2001). La contribution de chacune de ces deux voies à l’alimentation en azote de la plante varie beaucoup selon les espèces et les conditions de la culture (WERY, 1987). L’amélioration de la production des légumineuses et leur utilisation en tant que précédent cultural nécessite donc de mieux connaitre les relations entre l’assimilation et la fixation de l’azote, d’une part, et l’influence des facteurs du milieu et des techniques culturales sur ces deux voies, d’autre part (BOULBABA et al.,2009). Les résultats obtenus ont permis de mettre en évidence l’effet de la salinité sur les rendements en biomasse sèche, la production nodulaire, et les variations de la quantité d’azote total de la partie aérienne chez Vicia faba .L Afin d’expliquer l’influence de la salinité sur les paramètres de croissance des plantes, le poids sec de la biomasse végétale est mesuré. Il en ressort que des fluctuations importantes sont observées sous contraintes salines. Ainsi, les résultats indiquent que la salinité exerce une action dépressive et a entrainé une chute considérable de la production de matière sèche aérienne par rapport aux témoins avec une corrélation négative hautement significative sous stress NaCl (r = -0.382**). Néanmoins, cette influence reste variable en fonction des concentrations et du type de sels (NaCl et NaCl+CaCl2). Ces résultats révèlent un effet positif de l’apport de solutions salines sur les biomasses racinaires lorsque les plantes sont alimentées seulement au NaCl. Au contraire, sous la salinité au NaCl+CaCl2, ce paramètre varie à la hausse à salinité modérée (50 meq.l-1) pour chuter sous l’effet à forte concentration (200 meq). Les variations, en fonction des traitements, de l’effectif nodulaire enregistré indiquent d’une part, que l’apport d’une solution saline au NaCl conduit a une augmentation de la biomasse nodulaire jusqu’à 136% à salinité modérée, taux de nodulaion largement supérieur à celui du témoin et celui dénombré sur les racines des plantes conduites sous forte salinité. Outre la corrélation observée est hautement significative r = 0.515**. Cependant, le nombre de nodules par plante ainsi que le poids sec racinaire ont une corrélation positive hautement significative (r = +0.582**) sous stress salin au NaCl, en 68 Discussion et conclusion générales effet les résultats concluent que le nombre de nodules augmente avec l’accroissement de la biomasse racinaire sèche sous l’action du NaCl. L’amendement du milieu par le NaCl +CaCl2 provoque une augmentation significative de l’effectif nodulaire de 151.6% sous la salinité modérée, par contre il induit une diminution non significative de 19.6% sous la concentration de 200 meq.l-1comparée au traitement témoin. Les plantes agissent différemment à l’application du stress à l’eau de mer ; ce type de stress a provoqué une diminution notable de l’effectif en nodules par rapport au traitement témoin ; mais la comparaison entre les différentes concentrations fait ressortir une nette fluctuation des résultats obtenus. Les variations de la quantité d’azote total de la partie aérienne en fonction des traitements, se trouve fortement affectée par la contrainte saline. D’une manière générale, l’addition du NaCl dans le milieu crée par comparaison avec celle du traitement témoin, une légère baisse de 7.1% en réponse à l’application d’une salinité modérée. En revanche, une baisse plus marquée et hautement significative du niveau d’accumulation de l'azote de 45% est notée lorsque la concentration en NaCl quadruple (200 meq.l-1). Outre la corrélation observée est hautement significative r = -0.501**. L’application du NaCl+ CaCl2 à salinité modérée provoque une chute hautement significative de la teneur en azote, les parties aériennes demeurent plus riches en azote sous amendement du milieu par le NaCl+ CaCl2 à 200 meq.l-1 et se rétablit presque au même niveau du traitement témoin. Le stress à l’eau de mer à différentes concentrations a entrainé une baisse significative des quantités d’azote dans les parties aériennes. Il existe une légère corrélation positive (r = 0.357*) entre la quantité d’azote total de la partie aérienne et le poids sec aérien sous l’action du NaCl. En effet sous cette contrainte saline, la diminution du poids sec aérien est accompagné par une diminution des quantités d’azote alloué aux parties aériennes. L’exposition des plantes de Vicia faba .L inoculées par le Rhizobium à la salinité s’est traduit par une chute de la croissance pondérale surtout de la partie aérienne et une réduction du nombre de nodules. En effet, la salinité diminue la survie des rhizobia (ALEXANDER,1984 et DUA,1992) et inhibe l’expansion et la courbure des poils absorbants (SPRENT et ZAHRAN,1988). Elle entraîne une réduction du nombre de ces organes symbiotiques car le processus d’installation de la nodosité est plus sensible au stress osmotique que l’est le métabolisme des racines et des parties aériennes de la plante (ZAHRAN et SPRENT,1986). 69 Discussion et conclusion générales Chez la fève nous avons observé une chute du nombre de nodules par unité de masse racinaire en fonction du degré de la salinité accompagnée d’une augmentation de la taille des nodules colorées en rose et d’une résistance relative de la croissance des racines pour les stress salins appliqués au NaCl+CaCl2 à 200meq.l-1et à l’eau de mer. Toutefois, il semble que ces réponses dépendraient de l’espèce et de la résistance à la salinité de la bactérie utilisée pour l’inoculation (AYDI et al.,2008). En ce qui concerne les traitements d’inoculation, ils ont conduit à une amélioration modeste de la croissance nodulaire, Par ailleurs, les variations induites par l’inoculation avec des souches de bactéries symbiotiques, semblent dépendre surtout de la souche et du traitement subi par la plante. Dans l’ensemble, ces résultats suggèrent l’existence de populations indigènes de bactéries symbiotiques dans le substrat et leur capacité d’infecter et de noduler les racines de la fève,ce qui semble fortement stimulée sous contraintes salines. SAADLLAH et al. (2001) ont observé chez le haricot une chute de la croissance de racines associée à une augmentation du rapport nombre de nodule/unité de matière sèche racinaire. Les plantes de fève soumises à un stress salin au NaCl ont produit davantage de nodules de petite taille et de couleur blanchâtre par plantes, mais cela est dû probablement à la résistance des souches utilisées pour l’inoculation à la salinité. Cet effet positif de la salinité sur la croissance nodulaire serait le résultat d’une plus grande allocation de photosynthétats aux nodules (SANTIAGO et al.,2000). Dans un travail similaire sur le dolique, FIGUEIREDO et al. (1998) ont pu démontrer une efficacité de la souche d’inoculation dans de telles conditions qu’ils ont attribuées au contenu en leghémoglobine des nodules, au potentiel hydrique foliaire et au poids de matière sèche des racines. De nombreux auteurs ont montré qu’il existe une grande diversité parmi les souches isolées des nodules d’une même légumineuse (Zhang et al., 1991 ; Dupuy, 1993). Ndoye (1999) a constaté qu’il existe une diversité génétique au sein des populations locales de rhizobiums nodulants Acacia nilotique. Il était également possible de distinguer parmi des souches isolées des nodules d’haricot d’une même région un degré élevé de diversité génétique (Horta de SA et al., 1996). L’effet de la salinité n’est pas homogène pour tous les organes. Les réponses morphologiques, physiologiques et métaboliques de ces derniers sont différentes (HILAL et al.,1998) et parfois même opposées entre les stades juvéniles et adultes (MUNNS et TERMAAT,1986 et ZID,1989). 70 Discussion et conclusion générales D’après nos résultats, la salinité a réduit davantage la croissance des parties aériennes de la fève comparativement à celle des racines qui a marqué une nette progression. Des résultats similaires ont été rapportés par DUBEY et SINGH (1999). Cette résistance du système racinaire de la fève au stress salin peut être due à une diminution de l’allocation du carbone pour la croissance foliaire au profit de la croissance racinaire (BRUNGNOLI et BJORKMAN,1992). La réduction de la croissance peut être aussi liée à des perturbations des taux des régulateurs de croissance (acide abscissique et cytokinines) induites par le sel (KUIPER et al.,1990 ;TERMAAT et al.,1985), parfois à une réduction de la capacité photosynthétique suite à une diminution de la conductance stomatique de CO2 sous la contrainte saline (SANTIAGO et al.,2000). Néanmoins, il faut signaler que les effets de la salinité sur la croissance et la productivité ne sont pas toujours négatifs. Des concentrations assez élevées de NaCl, de NaCl+CaCl2 et d’eau de mer dans le milieu a conduit à une stimulation de la production de la matière sèche des racines de la fève. Une réponse analogue sur la stimulation de la production de la matière fraîche et sèche des organes aériens a été signalée chez la luzerne (HUSSAIN et al.,1995). La réponse des plantes stressées à la salinité se traduit par une réduction de leurs croissance (PAPDI et al.,2008). L’effet initial et primaire de la salinité est dû à ses effets osmotiques (OMAMI,2005) qui pourrait se produire en raison de l’accumulation des concentrations élevées de Na+ dans l’apoplaste des feuilles, puisque l’ion Na+ qui circule dans le xylème, y est abandonné après l’évaporation de l’eau (TESTER et DAVENPORT,2003). Il est également établi que la salinité restreint la production de biomasse à travers une limitation de l’absorption du potassium et du calcium (LACHAAL et al.,1995) et de leur transport (SOLTANI et al.,1990) ; un supplément de Ca++ dans le milieu de culture corrige ces effets (RENGEL,1992). Cette perturbation de la disponibilité du calcium inhibe également l’établissement de la nodulation (attachement bactérie poils absorbants) (ZAHRAN et SPRENT,1986). SMITH et al. (1988) signalent que des composés calciumdépendants de la paroi sont impliqués dans la reconnaissance Rhizobium-poil absorbant. L’augmentation du coût énergétique de la croissance en raison des différentes dépenses supplémentaires couvrant les besoins des transports ioniques et de l’ajustement osmotique aboutit à la réduction de la production de biomasse (BOHNERT et al.,1995). 71 Discussion et conclusion générales Il a été précédemment proposé que l'inhibition de l'activité de la croissance des légumineuses exposés au stress salin est due à une inhibition par le biais de la photosynthèse de plusieurs façons: réduction de l’expansion des feuilles (PARIDA et DAS ,2005) réduction de la teneur en chlorophylle des feuilles (GARG et SINGLA ,2004 ; JAMIL et al.,2007), l'inhibition in vivo de la Rubisco par de fortes concentrations de Cldans les chloroplastes (DEBEZ et al., 2006), rétro-inhibition du métabolisme du carbone à la suite de croissance réduite (AL-SOHBI et al.,2006) ou une combinaison de ces facteurs(CRAMER et al.,1990). Dans ce travail, la réduction de la croissance de la plante hôte serait la conséquence d'une restriction dans la fixation symbiotique de l’azote résultant d'une diminution de la biomasse des nodules tel que signalé par d'autres travaux (GARG et SINGLA.,2004 ; AYDI et al.,2008). Toutefois, une variabilité de la croissance de la plante et les teneurs en azote total en réponse au sel a été trouvée ; en effet, nos résultats montrent que la salinité a diminué les quantités d’azote dans les parties aériennes alors qu’elle n’affecte pas la croissance de la plante hôte . Par contre, des concentrations élevées en NaCl induisent une diminution des quantités d’azote total des parties aériennes enregistrée avec la diminution du nombre de nodules. Ce résultat est en accord avec d'autres travaux (SOUSSI et al., 1999; BABBER et al., 2000; BOUHMOUCH et al., 2005). Cet effet peut changer pour des concentrations en eau de mer pour lesquelles la quantité la plus élevée d’azote total déterminée est obtenue pour les plantes stressées à l’eau de mer non diluée et pour lesquelles le nombre de nodules reste le plus bas. Malgré cette réduction de l’effectif, en nodules, leur volume est plus important. Des travaux effectués sur le soja (SPRENT, 1981) ont souligné l’importance de la taille des nodules dans leur capacité à supporter les conditions sèches. Selon ces travaux, les nodules de petite taille perdent rapidement leur réserve en eau, alors que ceux de taille plus grande possèdent un parenchyme cortical plus épais qui empêche ou réduit leur déshydratation lorsque la culture est réalisée sur sol sec. Il apparait de plus que les nodules volumineux s’adaptent aux conditions du stress hydrique et salin, puisque les cellules microbiennes, y compris le Rhizobium, sont capables de résister à des potentiels hydriques plus bas que la plupart des cellules des plantes supérieures. Par conséquent, il est probable que depuis l’infection par le Rhizobium jusqu’au fonctionnement des nodules différenciés, les facteurs les plus importants qui limitent la fixation dans des conditions de stress hydrique résident dans la plante hôte (SANCHEZDIAZ et al., 1995). 72 Discussion et conclusion générales Cette diminution de l'efficacité nodule peut être expliquée par une inhibition de l'activité nitrogénase .Il a été proposé que, la diminution de l’activité de cette enzyme par le stress pourrait être attribuée à une diminution de la respiration des nodules à la suite d'une limitation dans l'approvisionnement des nodules en O2 (SERRAJ et al., 1995; Soussi et al., 2001) à cause d’une diminution de la conductance nodulaire à l'O2 (AYDI et al., 2004). Une augmentation de la pression d'oxygène dans l'environnement rhizosphérique du haricot nodulé a permis la suppression de l’effet inhibiteur du sel sur l'acétylène et la réduction de l’activité de la nitrogénase (SERRAJ et al., 1998). Nos résultats ont montré que la plus grande biomasse des nodules, sous la salinité au NaCl+CaCl2, a été liée avec la plus basse quantité d’azote totale enregistrée dans les parties aériennes. L'accumulation de sel pourrait se produire dans l’apoplaste et conduire à une perte d’eau dans les compartiments intracellulaires avec une plasmolyse des cellules du cortex interne et une réduction dans le volume de l'espace intercellulaire, comme une conséquence (AL PAREEK et al., 1997; BORUCKI et SUJKOWSKA, 2008). En outre l'accumulation d'eau, dans cet espace pourrait réduire considérablement la diffusion de l'O2 vers les bactéroïdes (AYDI et al.,2008). Étant donné les aléas de la pluviosité et la salinité en zone méditerranéenne en général et en Algérie en particulier, il serait souhaitable d’approfondir les recherches sur la nodulation et sur la fixation symbiotique de l’azote en condition de déficit salin et hydrique et afin de sélectionner des symbiotes fixateurs pour le maintien d’une bonne production agricole et d’une quantité d’azote appréciable au niveau du sol. L’amélioration de la fixation azotée pourrait être basée sur des populations natives. Des études devraient être conduites pour améliorer la capacité de nodulation de ces bactéries et une meilleure expression de leur potentiel de fixation de l’azote. La différence des caractères symbiotiques entre les populations natives des différents sites mérite d’être analysée en rapport avec la variabilité des conditions climatiques et édaphiques. Le type de sol peut être à l’origine de telles différences, comme il a été suggéré par TELLAWI et al., (1986), ces auteurs ont constaté que ce facteur affecte significativement le nombre, la biomasse des nodules et l’absorption de l’azote. Des études complémentaires sont nécessaires pour établir la relation entre la distribution des ions dans les nodules et leur efficacité. 73 Références bibliographiques A bdallah M.M.F., 1979 - The origin and evolution of Vicia faba L. In Proc.1 st Mediterranean Conf. Genet., p. 713-746. Abdelmoumen H., Filali-Maltouf A., Neyra M., Belabad A et Missbah Eiidrissi M., 1999- Effect of high salts concentrations on the growth of Rhizobia and reponses to added osmotica. Journal of Applied Microbiology. 86 : 889-898. Abrol Y. P et Ingram K. T., 1997 - Effets directs et indirects du changement des processus hydrologiques, pédagogiques et physiologiques des végétaux. FAO; 1997, ch. 6, p. 110-119. Affiana T et Alexander D., 1992- Difference amang cowpea. 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Annexe Annexe.1- Milieu de culture des rhizobiums YEM (Vincent, 1977) Extrait de levure 1g Agar-agar 20g Mannitol 10g Solution minérale de Bergensen 10M 100ml : KCl 1g FeCl3 0.02g CaCl2, 12H2O 0.53g Na2HPO4, 12 H2O 4.5g MgSO4, 7 H2O 1g H2O distillée 1000ml H2O distillée qsp 1000ml pH (6.9-7) Annexe.2- Calcul de la capacité de rétention du substrat L’arrosage des plantes est réalisé en tenant compte de la capacité de rétention du substrat calculé de la manière suivante : Nous avons déposé 100 g de sol (P1) dans un petit pot en plastique perforé à sa base, le tout est posé dans une boite de pétri, ensuite l’eau est versée dans le pot jusqu’à saturation, ce dernier est déposé sur la paillasse pour décantation ; au bout de 24h, le pot et le sol sont pesés, le poids est égal à 129.4 (P2) : - Soit P1 – P2 = 29.4 g (densité de l’eau = 1) d’où le volume d’eau pour 100 g. de terre est égal à 29.4 ml. - Il faut réduire le poids du pot = 4g soit le volume final de l’eau est de 25.4 ml pour 100 g de terre. Annexe Nous avons pour 100g de terre 25.4 ml d’eau, pour 1300 g de terre le volume est de 330.2 ml d’eau utilisée, pour l’arrosage de chaque plante à 100% de la capacité de rétention du sol. Annexe.3- Composition de l’eau de mer Principaux sels dissous pour une eau de mer de salinité 35 g/L5 Anions g/kg mol/kg Chlore (Cl-) 19,3524 0,54586 Sulfate (SO42-) 2,7123 0,02824 Bicarbonate (HCO3-) 0,1080 0,00177 Brome (Br-) 0,0673 0,00084 Carbonate (CO32-) 0,0156 0,00026 Fluor (F-) 0,0013 0,00007 Hydroxyde (OH-) 0,0002 0,00001 Cations g/kg mol/kg Sodium (Na+) 10,7837 0,46906 Magnésium (Mg2+) 1,2837 0,05282 Calcium (Ca2+) 0,4121 0,01028 Potassium (K+) 0,3991 0,01021 Annexe Strontium (Sr2+) Autres molécules écules 0,0079 0,00009 g/kg mol/kg Eau (H2O) 965 53,6 Acide borique (B(OH)3) 0,0198 0,00032 Tetrahydroxyborate (B(OH) (B(O 4-) 0,0079 0,00010 CO2* 0,0004 0,00001 Algues. Principaux ux composants com de l'eau de mer Annexe Annexe.4- Tableau des résultats pour les différents pramètres de Vicia faba L. stressées à la salinité au NaCl Traitements Salins Témoins 50meq.l-1 de NaCl 200meq.l-1 de NaCl Répétitions Nombre des nodules Teneurs en Azote totale Poids sec des parties aériennes Poids sec des racines 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 175 213 187 192 140 194 220 240 290 207 502 580 440 530 410 490 471 510 470 452 420 480 489 370 310 461 309 397 416 310 520 650 790 670 730 , , , , , 470 630 790 560 670 , , , , , 448 370 310 377 340 , , , , , 5.29 5.14 5.25 5.10 4.74 5.23 4.62 5.26 4.78 5.20 4.36 4.42 4.89 4.48 4.99 5.06 5.57 4.32 4.48 4.33 5.68 4.70 4.48 4.83 3.87 4.35 2.80 4.81 3.80 4.09 1.00 1.47 1.61 1.46 1.61 2.17 1.38 1.61 1.85 1.77 2.28 2.89 2.70 3.73 2.18 2.81 2.70 3.13 2.26 2.09 2.15 3.61 2.94 2.73 1.63 2.62 3.11 2.62 3.14 2.91 Annexe Annexe.5- Tableau des résultats pour les différents paramètres de Vicia faba L. stressées à la salinité au NaCl+CaCl2 Traitements Salins Témoins 50meq.l-1 de NaCl+CaCl2 200meq.l-1 de NaCl+CaCl2 Répétitions Nombre des nodules Teneurs en Azote totale Poids sec des parties aériennes Poids sec des racines 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 175 213 187 192 140 194 220 240 290 207 502 580 440 530 410 490 471 510 470 452 420 480 489 370 310 461 309 397 416 310 520 650 790 670 730 3.67 4.26 4.07 3.98 4.17 4.04 4.03 3.91 4.35 4.03 5.32 4.24 3.94 4.46 4.04 4.47 3.92 4.67 4.91 3.96 3.67 4.26 4.07 3.98 4.17 4.04 4.03 3.91 4.35 4.03 2.99 2.42 3.18 2.66 2.35 2.13 2.86 1.59 2.32 1.67 1.09 1.77 1.51 1.76 1.34 1.04 1.48 1.83 1.52 2.25 2.99 2.42 3.18 2.66 2.35 2.13 2.86 1.59 2.32 1.67 , , , , , 470 630 790 560 670 , , , , , 448 370 310 377 340 , , , , , Annexe Annexe.6- Tableau des résultats pour les différents paramètres de Vicia faba L. stressées à l’eau de mer Traitements Salins Témoins Eau de mer 25% Eau de mer 50% Eau de mer 100% Répétitions Nombre des nodules Teneurs en Azote totale Poids sec des parties aériennes Poids sec des racines 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 175 213 187 192 140 194 220 240 290 207 97 158 190 88 113 172 202 109 107 153 104 115 253 206 193 259 220 189 203 108 152 160 182 113 204 192 108 175 183 167 520 650 790 670 730 3.67 4.26 4.07 3.98 4.17 4.04 4.03 3.91 4.35 4.03 5.03 4.20 4.32 4.73 4.52 4.67 4.46 4.11 3.82 4.81 4.32 4.69 4.43 3.15 3.93 4.66 3.86 4.86 4.75 4.73 3.70 4.26 4.56 4.53 3.66 4.65 4.06 3.89 4.78 3.25 2.99 2.42 3.18 2.66 2.35 2.13 2.86 1.59 2.32 1.67 2.15 2.19 1.98 1.92 2.48 2.11 1.87 2.59 1.79 2.30 1.60 1.70 2.22 2.17 2.09 1.88 2.01 1.80 1.99 2.47 1.24 1.23 1.84 2.39 2.34 1.89 2.35 1.88 1.81 2.12 , , , , , 420 355 290 250 270 , , , , , 420 337 255 250 252 , , , , , 460 490 530 273 400 , , , , , Annexe Annexe.7- Tableau des corrélations des paramètres mesurés Corrélations TRAITM NBRENOD AZOTE PSR PSA Corrélation de Pearson Sig. (bilatérale) N Corrélation de Pearson Sig. (bilatérale) N Corrélation de Pearson Sig. (bilatérale) N Corrélation de Pearson Sig. (bilatérale) N Corrélation de Pearson Sig. (bilatérale) N -,515** ,000 80 -,501** ,00.1 40 -,042 ,795 40 -,183 ,104 80 ,582** ,000 80 -,305 ,056 40 -,382** ,000 80 -,062 ,584 80 ,357* ,024 40 ** La corrélation est significative au niveau 0.01 (bilatéral). * La corrélation est significative au niveau 0.05 (bilatéral). -,184 ,103 80 Annexe Annexe.8 - Comptage des nodules Annexe.9- La conductivité électrique La conductivité électrique de l’échantillon de sol est de 0.64 mmhos/cm (peu salé). 0.6 1.2 2.4 6 mmhos/cm Fig.23- Échelle de la conductivité électrique (CE) du sol en mmhos/cm CE > 6 → Extrêmement salé 6< CE > 2.4 → Très salé 2.4 < CE > 1.2→ Salé CE = 0.6 →Peu salé CE < 0.6 →Non salé