EMBRYOLOGIE LES OURSINS Les oursins appartiennent au phylum des Echinodermes, il en existe 7000 espèces, toutes marines, réparties en 5 classes. - Classe des Echinides (oursins, 900 espèces) - Classe des Astérides (étoiles des mers) - Classe des Holothurides (concombres de mer) - Classe des Ophiurides (ophiures) - Classe des Crinoïdes (lilas des mers) I- Anatomie et avantages/inconvénients 1- Anatomie - Deutérostomiens : formation de l’anus { partir du blastopore (région anale se développe avant la région buccale) + capacité de régulation des blastomères. - Segmentation radiaire d’ordre 5 (pentaradiaire) : les plans de clivage sont parallèles ou perpendiculaires { l’axe primordial (= axe animal-végétatif). Le test calcaire de l’oursin donne la forme globulaire de l’oursin adulte. Celui-ci est formé de cinq plaques riches en calcium soudées les unes aux autres 5 doublets de bandes sombres (=région ambulacraire) et claires. - Segmentation est holoblastique (divisions totales). - Pas de critères sexuels secondaires qui permettent de différencier le mâle de la femelle. - Vie sur fonds benthiques la face orale tournée vers le sol afin de se nourrir d’algues grâce à un appareil masticateur = « Lanterne d’Aristote » qui comporte 5 dents calcaires alternées avec les compas (pièces squelettiques articulées faisant office de pince) + muscles rétracteurs et transverses pour faire bouger les dents. - A l’opposé, on trouve la face aborale, qui constitue la région ano-génitale qui rejette les excréments. - Les régions ambulacraires portent les podias. - Les régions interambulacraires portent les piquants. - Les piquants ne permettent pas le mouvement, contrairement aux pieds ambulacraires, sur lesquels sont fixés des podia (= ventouses). 2- Avantages/inconvénients de l’oursin pour l’étude du développement Avantages : - Grande production de gamètes : la femelle 107 ovocytes et le mâle 1012 spermatozoïdes, de façon à augmenter les probabilités de fécondation dans le milieu extérieur (= eau). - Fécondation et développement externes : très facilement observables et réalisables in vitro. Embryologie 2010 Page 1 - Le développement de l’embryon d’oursin est très rapide, on obtient au bout de deux jours une larve et est aussi synchrone, signifiant que toutes les larves croitront de manière identique au fil du temps. - L’œuf et l’embryon d’oursin sont transparents (possède peu de réserves = vitellus), ainsi, on peut facilement observer les types cellulaires { l’intérieur du blastocœle. Il est synchrone : segmentation à espaces réguliers, chaque embryon se divise au même moment que le voisin. Et il possède une taille permettant une manipulation facile par micro-injections (ADN, ARN, morpholinos) grâce à des micropipettes. - Les embryons sont manipulables facilement, on peut ainsi effectuer aisément des transplantations. Protéines et la structure de l’embryon au stade larvaire est simple, avec un faible nombre de cellules. Inconvénients : - Analyse génétique classique impraticable car temps de génération trop long (quelques années). - Production saisonnière des gamètes (de janvier à juin pour Paracentrotus lividus). II- La reproduction Le cycle vital est très long (de la fécondation à la larve pluteus : 2 jours). Spermatozoïde + ovule Développement d’une larve nageuse Echinopluteus (plancton) Formes rudimentaires et organes larvaires résorbés Juvénile Métamorphose et ancrage au sol adulte 1- Les gamètes Pour les observer, on dissèque les oursins au niveau de l’équateur. Les gamètes seront expulsés grâce à des petits canaux débouchant sur cinq orifices génitaux au niveau de la plaque aborale. 5 gonades par individus. Les oursins pratiquant l’oogamie : seul le spermatozoïde est mobile. Spz.= un acrosome qui renferme des protéines (principalement des hydrolases, de l’actine G et de la bindine). + un flagelle est composé de 9 axonèmes, euxmêmes formés de doublets de microtubules ainsi que des protéines (dynéine interne et externe), permettant aux microtubules de glisser les uns sur les autres. Il ne possède qu’une seule membrane. Embryologie 2010 Page 2 Les ovocytes Diamètre de 100µm. Pendant l’ovogenèse, les ovocytes vont maturer et donner des œufs non fécondés et orientés selon un axe animal-végétatif : pôle animal et pôle végétatif respectivement définis par la présence d’un canal par lequel seront expulsés les deux globules polaires au cours de la maturation de l’ovocyte, et par le point d’ancrage de l’œuf { l’ovaire. L’œuf est lié { l’ovaire pendant l’ovogénèse par le pôle végétatif. Il possède 3 types de membranes : - membrane plasmique (mb interne) -enveloppe vitelline, collée à la membrane plasmique, forme des microvillosités. Apres la fécondation, cette mb vitelline va se décoller, pour mettre en place l’enveloppe de fécondation. - gangue gélatineuse (mb externe) : composée de nombreux sucres, elle reste fine tant que l’œuf se trouve dans l’ovaire, et servira par la suite de flotteur { l’œuf (se gorge d’eau une fois l’œuf pondu). Elle va devenir très épaisse et va jouer un rôle de reconnaissance du spermatozoïde durant la fécondation : elle est capable d’attirer via un mécanisme de chimiotactisme les spermatozoïdes d’oursins de même espèce. Impliqué dans ce mécanisme, on a pu isoler un peptide de 14 acides aminés, la resact, synthétisée par la gangue gélatineuse. Sous la membrane plasmique, on trouve une grande quantité de vésicules, les granules corticaux. Ceux-ci auront un rôle important à jouer lors de la fécondation. Après expulsion, le courant va disséminer les gamètes dans le milieu marin, et ils vont se rencontrer pour faire la fécondation. Une espèce d’oursins sera incapable de féconder une espèce étrangère, du fait de mécanismes propres à leurs gamètes respectifs. 2- La fécondation Les oursins n’ont pas de caractères sexuels secondaires mais si un oursin possède de nombreux gamètes matures prêts à être expulsés, il y aura en son sein, soit une substance orangée, soit une substance blanche près du pôle aboral. Les ovocytes et les œufs sont très orangés, car ils expriment un pigment au niveau de leur cortex. Les œufs sont beaucoup plus gros et denses que les spermatozoïdes, les oursins étant anisogames. Contrairement { d’autres espèces animales, le spermatozoïde d’oursin va pouvoir pénétrer dans l’œuf { n’importe quel niveau. Le premier contact entre l’œuf et les spermatozoïdes va activer les deux gamètes : Réaction acrosomale du spermatozoïde = exocytose de la vésicule acrosomale : les protéines vont être libérées et les hydrolases qui vont digérer la gangue gélatineuse. L’actine sous forme globulaire (G) va polymériser en actine F et former le filament acrosomal. La bindine de la membrane de l’acrosome va être reconnue par un récepteur au niveau de la membrane vitelline de l’œuf. Embryologie 2010 Page 3 La création du complexe bindine/récepteur permet la fusion des deux membranes, et la pénétration du noyau dans l’œuf et permet d’éviter une fécondation interespèce. Une enzyme va ensuite digérer la mb vitelline, et la tête du spermatozoïde va fusionner avec la membrane plasmique de l’œuf. 2 réactions de l’œuf pour éviter la polyspermie L’œuf est chargé négativement avant la fécondation (-75 mV), en cas de fécondation, un flux entrant ou sortant d’ions va bouleverser ce potentiel. La dépolarisation induite empêchera la fixation des spermatozoïdes surnuméraires sur l’œuf. La réponse à la fécondation est rapide, et le potentiel de membrane retrouve un niveau normal au bout d’une dizaine de minutes. Réaction corticale : les granules corticaux vont déverser leur contenu protéique par exocytose, ce qui va provoquer un soulèvement de la membrane vitelline : elle va se décoller de la membrane plasmique. En effet, des protéases vont couper les liens entre les deux membranes. Des sucres vont être relargués et créer un gradient osmotique pour permettre à l’eau de mer de rentrer entre les deux membranes, et créer l’espace périvitellin. L’enveloppe de fécondation est la membrane vitelline qui a été modifiée après la fécondation. C’est une enveloppe très résistante, qui assure une protection définitive contre la polyspermie. Une couche de hyaline va entourer l’œuf pour assurer la cohésion des cellules pendant la division. Schéma de l’œuf fécondé Embryologie 2010 Page 4 III- De L’œuf à l’oursin 1- La segmentation Après une demi-heure, il y a fusion des noyaux des deux gamètes, et formation d’un zygote. On appelle cette fusion amphimixie. L’œuf va ensuite se diviser et mener à un organisme pluricellulaire par une segmentation orientée selon l’axe animal-végétatif, holoblastique (d’un pôle { l’autre), totale, radiaire et réductive (les cellules ont des tailles de plus en plus petites mais la taille de l’embryon reste la même). Le 1er plan de clivage est méridien, débute sous forme d’une contraction corticale. Les 2 cellules issues de cette segmentation sont des blastomères. Stade 2 : Le 2e plan clivage, perpendiculaire au premier, va donner naissance à 4 blastomères de taille identique. S Stade 4 : Le 3e plan de clivage va être situé { l’équateur, et donner 4 cellules dans l’hémisphère du pôle animal, et 4 cellules dans l’hémisphère du pôle végétal. La bande pigmentaire est contenue dans les blastomères inférieurs Stade 8 : Les 4 cellules du pôle végétal vont se diviser asymétriquement avec formation de petites cellules au pôle végétatif, et de grandes cellules au pôle animal + formation d’une cavité entre les blastomères = blastocœle. Stade 16 : les blastomères supérieurs vont se diviser de façon méridienne et donneront les mésomères. Les blastomères inférieurs vont se diviser de façon latitudinale décalée et donneront 4 macromères et 4 micromères. Stade 32 : Les mésomères subissent une division équatoriale et donneront les cellules an1 et an2. Les micromères vont subir une division latitudinale asymétrique pour donner naissance aux grands et aux petits micromères. Les mésomères se diviseront de façon méridienne pour en former 8. Stade 64 : les macromères subissent une division équatoriale pour donner deux assises végétatives veg1 et veg2 A partir du stade 128 cellules on obtient un embryon appelé blastula. Chaque cellule va acquérir un cil, servant à faire tourner la blastula. A la fin de ce stade, il va y avoir éclosion de l’enveloppe de fécondation (10-12h après la fécondation): les cellules de la partie animale vont synthétiser l’enzyme d’éclosion qui va digérer l’enveloppe et libérer la blastula flotteuse capable de « nager » grâce à ses cils. Embryologie 2010 Page 5 Les cellules du pôle animal + une partie de veg1 vont donner l’ectoderme. Une partie des cellules de veg1 et veg2 va donner l’endoderme (qui donnera le TD). Les micromères + une partie de veg2 vont donner le mésoderme (mésenchyme) Au pole animal, les cils des cellules sont très longs : on parle de touffe ciliaire apicale qui joue un rôle de gouvernail. Il faut que les cellules composant cet épithélium adhérent les unes aux autres de manière très coordonnée. Ainsi, il y a une jonction cellulaire entre la face apicale et la couche hyaline côté apical, et entre la face basale et la matrice extracellulaire tapissant la paroi du blastocœle. Cet ensemble permet d’obtenir un embryon parfaitement sphérique. 2- La gastrulation Après l’éclosion, l’embryon est appelé blastula tardive. Celle-ci va s’aplatir au niveau du pôle végétatif Formation de la plaque végétative = épaississement du pôle végétatif. Un embryon de cette forme est significatif d’un début de gastrulation. Les grands micromères vont changer de propriétés : ils perdent leur polarité et leur cil apical. Puis ils vont s’extirper de l’épithélium par un phénomène d’ingression, vont pénétrer à l’intérieur du blastocœle et devenir des cellules du mésenchyme primaire (PMC) c’est la « transition épithélium – mésenchyme ». Quand les cellules auront pénétré dans le blastocœle, les cellules non-PMC vont adhérer les unes aux autres pour refermer l’épithélium unicellulaire. On arrive au stade blastula avec mésenchyme. La gastrulation commence par la constriction apicale des cellules épithéliales, qui leur confèrent une forme dite « en bouteille » La plaque végétative s’invagine donc, formant le blastopore et l’archentéron. Les cellules du PMC vont former des filopodes (extension cellulaires) qui vont s’étendre dans le blastocœle afin de vérifier la composition des parois ce qui va permettre { l’archentéron de s’allonger sur une longueur correspondant au tiers de l’embryon. On parle de gastrula précoce. Embryologie 2010 Page 6 Une seconde phase d’élongation fera intervenir des cellules se trouvant au sommet de l’archentéron, les cellules du mésenchyme secondaire (SMC), provenant des petits micromères et d’une partie des cellules de l’assise cellulaire veg2. Celles-ci vont émettre des filopodes, parfois très longs, en direction du toit du blastocœle. Une fois arrimées, elles vont pratiquer une force de traction par raccourcissement de leur filopodes qui permettra l’allongement de l’endoderme vers le pôle animal. Par la suite, elles se détacheront pour se disperser dans le blastocœle, où elles formeront des organes mésodermiques Parallèlement, les cellules du PMC forment 2 amas cellulaires, de part et d’autres de l’archentéron au niveau du pôle oral. Ces deux amas sont reliés entre eux par une chaîne orale et une chaîne aborale. Les cellules de chaque amas vont ensuite fusionner les unes avec les autres et former 2 syncytiums. Il va y avoir un dépôt de carbonate de calcium, qui va former 1 spicule triradiée dans chaque syncytium. Ces spicules vont s’allonger en suivant les chaînes Formation du squelette de l’embryon. Les cellules pigmentaires vont se détacher de l’archentéron et migrer vers l’ectoderme (c’est ce qui va donner sa couleur { l’embryon). Le blastopore quant à lui, va donner l’anus. 3- Le stade larvaireprismepluteus Jusqu’{ ce stade, l’embryon possède une symétrie radiaire. Mais alors que les cellules épidermiques aborales s’allongent, les orales restent aplaties : c’est la dépression stomodéale formation de la bouche par fusion de cet ectoderme avec le sommet de l’archentéron. Mise en place de l’axe oral – aboral, perpendiculairement à l’axe animal–végétatif apparition de la symétrie bilatérale stade larvaire. L’ectoderme oral va s’aplatir et l’ectoderme aboral va s’agrandir. Stade prisme. Les 4 bras anaux vont s’allonger. Stade pluteus. Développement d’une bandelette ciliée permettant à la larve de se déplacer face orale en avant. En battant, les cils vont créer un courant d’eau et attirer des microorganismes vers la bouche de la larve. L’archentéron formera petit { petit œsophage, estomac, intestin et anus. Les deux spicules se rejoignent au niveau de la face dorsale de la larve. 2 jours après la fécondation la larve est planctonique et autonome. Les cellules du mésenchyme secondaire (SMC) micromères et de l’assise veg2 vont contribuer { la formation de deux vésicules cœlomiques, de part et d’autre de l’archentéron. C’est { partir du cœlome gauche que se forme un petit oursin par métamorphose. Embryologie 2010 Page 7 4- La métamorphose La transformation ayant lieu lors d’une métamorphose, le développement de l’oursin est donc indirect. La plupart des cellules embryonnaires sont détruites lors de cette métamorphose. Le cœlome gauche se divise en 3 parties : - Axocoele - Hydrocoele - Somatocoele L’hydrocoele gauche va fusionner avec une partie de l’ectoderme (le vestibule) et former le rudiment. Puis il va bourgeonner et former 5 vésicules. C’est le début de la pentamérisation. L’ « amnios » formé correspond au vestibule. A partir de ce rudiment, au sein même de la larve, il y aura formation du juvénile, oursin miniature garni de quelques piquants et de cinq podia primaires qui va se poser sur un rocher et qui va grossir. A la suite de la métamorphose, nous retrouverons une symétrie radiaire pentaradiée. Elle peut être mise en évidence avant la formation du test calcaire via l’observation des 5 plaques calcaires. La cavité amniotique s’ouvre, et les restes du pluteus non utilisé pour la métamorphose sont ingérés par le juvénile. Au fur et { mesure que l’animal est alourdi par son squelette et ses piquants calcaires, l’oursin descend vers les fonds marins. La formation du juvénile prend 5 à 6 semaines. IV- L’axe animal – végétatif Plusieurs critères permettent d’identifier l’axe animal végétatif, par exemple sur un œuf avant la fécondation : - Sur l’œuf, le canal permettant l’expulsion des globules polaires - La bande pigmentée se situant sous l’équateur, visible seulement chez Paracentropus lividus, due { un colorant s’accumulant dans des granules corticaux. - Le premier plan de division est méridien. Il passe donc par les pôles de l’œuf. - Des le stade 16, on peut repérer pôle animal et pôle végétal. A partir des autres stades, il redevient difficile de les identifier, les cellules se divisant de plus en plus. Avant la gastrulation, on sait qu’aura lieu un aplatissement de la plaque végétative. Embryologie 2010 Page 8 Les chercheurs ont essayé de comprendre des différents rôles de l’œuf, pour cela, ils ont dans un premier temps pris un œuf qu’ils ont pu orienter, pour ensuite en faire des coupes. - A : une coupe méridienne permet l’obtention de larves pluteus quasi-normales (mise à part la taille). - B : Une coupe équatoriale permettra quant à elle l’obtention d’une blastula permanente pour la moitié animale, et une larve pluteus quasi-normale pour la moitié végétative. Cette expérience nous indique que les moitiés animales et végétatives d’un œuf n’ont pas les mêmes propriétés. Ainsi, la partie végétative semble la plus harmonieuse pour la formation d’un embryon. Les chercheurs ont réitéré l’expérience pour des embryons au stade 4. Chaque blastomère séparé est à ce stade capable de donner naissance à des larves pluteus normales. Pour des embryons au stade 8, on a : - A : séparés de façon méridienne, formation d’embryons normaux - B : séparés de façon équatoriale, un seul animal sera viable L’axe animal végétatif est donc formé avant la fécondation, démontrant l’existence de la polarité animale/végétative. Au niveau de la moitié végétative, il peut y avoir présence de substances plus importantes qu’au pôle animal pour le développement de l’embryon. Pour confirmer ces résultats, les chercheurs ont pris des embryons au stade 64, où les différentes assises sont mises en place et actives. Quand on ne conserve que la moitié animale, on obtient des embryons animalisés composés uniquement d’ectoderme. Si l’on rajoute { cette moitié animale l’assise cellulaire veg1, on obtient au bout de 24h un embryon dont l’animalisation sera plus faible, les cellules veg1 participant { la formation de l’endoderme. La moitié animale avec veg2 donnera une larve pluteus quasiment normale. Embryologie 2010 Page 9 Quant { la greffe de 4 micromères { une moitié animale, il y a obtention d’une larve pluteus normale. On conclut donc que les micromères ont le plus d’activité lors de la formation de larves normales. Les autres cellules ont également un rôle évident, mais plus faible. En comparaison, les cellules veg1 ont un rôle minimal. Ainsi, on suggère qu’il existe un gradient végétatif avec un maximum d’activité au niveau des micromères : au plus on s’éloigne du pôle végétatif, au moins le gradient est fort. Les micromères se comportent alors comme un centre organisateur, c'est-àdire une zone de l’embryon importante dans la différenciation des autres cellules de l’embryon. V- Pouvoir inducteur des micromères On prend un embryon sur lequel on ôtera les micromères. A partir de ceux-ci, on effectuera une expérience de greffe, et on les installera au pôle animal d’un embryon au même stade. Pour pouvoir distinguer les micromères greffés des micromères endogènes, on colore une des deux groupes avec un traceur fluorescent. Au moment de la gastrulation, l’embryon receveur formera des PMC, l’archentéron, il y aura élongation, et formation des spicules. A partir du pôle animal, un second archentéron se formera, ainsi, l’embryon possédera deux archentéron qui se rejoindront par la suite. Les micromères ont donc la capacité de reprogrammer les cellules animales de l’ectoderme pour qu’elles forment de l’endoderme (=archentéron) Les chercheurs ont montré qu’il est possible de modifier le devenir des cellules au cours du développement de l’embryon. On peut montrer avec des marqueurs anticorps que les enzymes d’éclosion ont une certaine répartition. Certains produits chimiques peuvent en déplacer la frontière. - Quand on rajoute du lithium, la frontière sera déplacée vers le pôle animal. Ainsi, la zone d’expression de l’enzyme d’éclosion sera réduite. Moins de cellules formeront de l’ectoderme. Il y a formation d’un embryon végétalisé. La larve a exogastrulé, signifiant que la gastrulation s’est faite { l’extérieur de l’ectoderme. - Si on traite des embryons avec du zinc, il y aura déplacement de la zone vers le pôle végétatif, les embryons seront animalisés. Toutes les cellules appartiennent { l’ectoderme. Embryologie 2010 Page 10 Embryologie 2010 Page 11