SSBCV

Ecole Doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (SSBCV)
Directeurs : Philippe Roingeard & Luigi Agrofoglio
1. Titre de la thèse : Le peroxysome : un organite autonome pour la synthèse de terpènes
chez les levures et les plantes?
2. Informations administratives :
Nom de l’encadrant responsable de la thèse : Dr. Marc CLASTRE (MCU HDR)
Nom des co-encadrants : Dr. Vincent COURDAVAULT (MCU)
Dr. Nicolas PAPON (MCU HDR)
Unité : EA2106 Biomolécules et Biotechnologie Végétales
Email de l’encadrant : [email protected]
3. Résumé :
De récents travaux de l’EA2106 ont conduit à reconsidérer le schéma classique de localisation
subcellulaire de certaines enzymes catalysant des étapes précoces du métabolisme terpénique
en montrant qu’elles n’étaient pas localisées dans le cytosol mais plus spécifiquement
adressées aux peroxysomes. A l’aune de ces données nouvelles et bien que le sujet fasse
débat, la question de l’autonomie du peroxysome pour la synthèse de ses propres terpènes
peut être posée, comme suggéré chez les mammifères. A ce titre, le présent projet vise à
réévaluer la compartimentation de voies métaboliques de terpènes finaux, via la
caractérisation de la localisation subcellulaire des enzymes de ces voies, chez les plantes ainsi
que chez les levures pour lesquelles seules quelques données éparses ont laissé entrevoir un
possible rôle des peroxysomes dans la biosynthèse des terpènes. Afin de réaliser cette étude,
le choix s’est porté sur la plante modèle Arabidopsis thaliana, pour laquelle il existe de vastes
ressources génomiques et sur la levure Candida guilliermondii dont le génome est séquencé et
qui présente un fort potentiel biotechnologique. La sélection des gènes candidats s’effectuera
sur la base d’analyses bioinformatiques laissant entrevoir que certaines enzymes, dont
notamment celles issues de familles multigéniques comme les prényltransférases, puissent
être adressées au peroxysome car elles possèdent des motifs d’adressage PTS (Peroxisome
Targeting Signal) putatifs. Deux types de PTS sont impliqués dans l'
import des protéines dans
les peroxysomes : les PTS1 et PTS2 qui utilisent respectivement les récepteurs Pex5 et Pex7
pour assurer l’acheminement des protéines au sein de ces organites. Dans un premier temps,
la validation fonctionnelle des enzymes d’A. thaliana et C. guilliermondii sera réalisée par
complémentation de souches mutantes de Saccharomyces cerevisiae ou de souches
d’Escherichia coli modifiées. Sur cette base, les études d’adressage aux peroxysomes de ces
protéines seront réalisées à l’aide d’un panel d’outils moléculaires mis en place au sein de
notre équipe et utilisant l’imagerie GFP. Ainsi, l’adressage des enzymes fusionnées à des
protéines fluorescentes sera appréhendé par transformations transitoires de cellules de C.
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Site Tours, 3 rue des Tanneurs, 37041 Tours Cedex
Tel 02 47 36 67 07 Fax 02 47 36 65 62
roseus et par transformation de C. guilliermondii, puis validé par l’étude des conséquences de
mutations de leur motif PTS. Pour certaines enzymes, une production d’anticorps sera
également entreprise afin de confirmer les localisations par fractionnement cellulaire et
immunodétection. En outre, l’utilisation de mutants « perte de fonction » pour les systèmes
d’importation peroxysomale (pex5 et pex7 ) permettra d’établir finement par quelle voie
d’import, Pex5 ou Pex7, transitent les enzymes (fusionnées aux protéines fluorescentes). Les
résultats seront renforcés par des études d’interaction de ces enzymes avec leur récepteur en
utilisant des approches de double hybride de levure et de complémentation bimoléculaire de
fluorescence (BiFC). Enfin, les adressages des enzymes seront mis en perspective avec la
dynamique des peroxysomes et notamment leur prolifération, inductible par le clofibrate chez
les plantes et par l’acide oléique chez les levures. A terme, l’obtention de tels résultats de
localisation permettra de proposer un modèle d’architecture des voies de biosynthèse de
terpènes finaux, à la fois chez les plantes et les levures, sur la base d’analyses expérimentales.
Ceci devrait permettre également d’identifier la nature des composés terpéniques synthétisés
dans les peroxysomes et d’évaluer ainsi son niveau d’autonomie. La réévaluation de la
compartimentation du métabolisme terpénique trouve également un intérêt dans une
perspective d’ingénierie métabolique des espèces végétales et fongiques. Jusqu’à présent,
l’optimisation de l’ingénierie métabolique a essentiellement porté sur des stratégies visant à
réguler l’expression des gènes. Toutefois, un organisme eucaryote peut être considéré comme
un « écosystème » d’organites opérant une régulation spatiale de ses chaînes métaboliques.
Dans cette optique, l’élucidation de la compartimentation de la voie de biosynthèse des
terpènes, fournissant les précurseurs de molécules complexes, est un pré-requis indispensable
pour élaborer de véritables stratégies d’adressage d’enzymes hétérologues dans un
compartiment subcellulaire précis, en vue d’optimiser les flux métaboliques vers la
production de molécules d’intérêt.
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