UNIVERSITE DES SCIENCE TECHNOLOGIQUE HOUWARI BOUMEDIENE Méthode physico-chimique Tp3 :Electrophorèse SDS-page Realisé par: BOUREMANA meriem SALAH MANSOUR Houda Group: G1 Année universitaire : 2019 / 2020 Plan : I. II. III. IV. V. VI. VII. VIII. Introduction But Principe Matériel Méthode Résultat Interprétation Conclusion I. Introduction : Les protéines on été définies comme étant des macromolécules biologiques présentes dans toutes les cellules vivantes, elles sont formées d’une ou plusieurs chaines polypeptidiques. Chacune de ces chaines est constituée de l’enchainement de résidus d’acides aminés liés entre eux par des liaisons peptidiques. Elles sont sous forme de réserve dans les graines (les protéagineux) comme la fève et les petits pois. II. But : Séparation de protéines des feuilles et des graines pour déterminer le poids moléculaire. III. Principe : Séparation des macromolécules chargées a travers un gel sous l’effet d’un champ électrique. IV. Matériel : V. Mortier Graines et feuilles de blé Tampon (tris-HCl, glycérol, béta-mercaptoéthanol) Centrifugeuse Electrophorèse Bleu de bromophénol Tube à essai Méthode : Extraction : Dans deux mortier on fait l’extraction des graines et feuilles de séparément a sec puis on continue de broyer avec un tampon (tris-HCl, glycérol) car les protéines sont solubles dans un milieu basique et on ajoute le béta mercaptoéthanol pour détruire les Pons disulfures et on centrifuge pendant 5 min (15000 tr/min). Le surnageons est récupéré et les protéines sont dosées selon la méthode de Bradford a 595 nm en utilisant une gamme étalon de BSA. Préparation des 2 gels : Gel de migration 15% il permet la séparation des molécules : - acrylamide + Bis acrylamide - Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 - eau distillée Au dernier moment ajouter -PSA : un indicateur de polymérisation -Du TEMED N, N, N’, N’- tétraméthylénediamin : accélérateur de polymérisation (il est en solution) D’abord, on met un peigne dans l’electrohorèse pour tracer la limite du gel de migration puis verser une gélose pour éviter les fuites du gel et verser le gel de migration immédiatement avant qu’il se gélifier. Entre temps on prépare le gel de concentration 5% : -acrylamide + Bis acrylamide -Tris-HCl 0,5 M pH 6,8 -Eau distillée -TEMED -PSA (persulfate d’ammonium) a 10% Apres la polymérisation du gel de migration verser le gel de concentration sur le premier et placer le peigne profondément laissé polymériser 15 a 20 min. Dosage : 1 ml de l’extrait de feuilles + 3 ml de Bradford dans 2 tubes. 20 µl de l’extrait de graines + 3 ml de Bradford + dilution 1/5 80 µl de l’eau dans deux tubes. Après agiter les dans un agitateur. Enlever le peigne, retourner l’appareil puis a l’aide d’une seringue déposer les échantillons après avoir calculé la quantité a déposer. VI. Résultat : Feuilles Graines 1 0,71 0,51 2 0,84 0,69 Moyenne 0,77 0,6 concentration 1,52 6 DO = 0,506 [C] [C] = [C] = 0,77 0,506 0,6 0,506 = 1,52 mg / ml = 1,18 * 5 = 6 -Graine : 6 mg →1 ml 6 µg → 1µl 50 µg → 8 µl d’extrait 80 µg → 13 µl 35 µg →5 µl Vol extrait Graine 35 5 µg Graine 50 8 µg Graine 80 13 µg eau Dénaturant 10 15 µl *4 7 15 µl *4 2 15 µl *4 20 / 10 *4 15 / 15 *4 -Feuille : 1,5 mg → 1 ml 1,5 µg → 1 µl 50 µg→ 33 µl 30 µg→ 20 µl 20 µg→ 13 µl Feuille 30 µg Feuille 23 µg Distance parcourue 4mm 8mm 12mm 18mm 23mm 37mm 44mm Tache1 Tache 2 Tache3 Tache4 Tache5 Tache6 Tache7 Log de poids 2.25 2.06 1.95 1.76 1.68 1.55 1.41 Log de poids 2,5 2 y = -62.4ln(x) + 108.1 1,5 Log de poids 1 Логарифмическая (Log de poids) 0,5 0 0 2 4 6 8 y= -62.4ln(x) + 108.1 1 : y= -62.4 ln (1.2) + 108.1= 96.72 kDa 2 : y= -62.4 ln (2.5) + 108.1 = 50.92kDa 3 : y= -62.4ln (3) + 108.1 = 39.54 kDa 4 : y= -62.4ln (4.1) + 108.1 = 20.05kDa VII. interprétation : D’après les résultats d’électrophorèse on a obtenus des bandes représentes les protéines présentent dans les feuilles et graines. D’après le nombre de bande obtenu la quantité des protéines présentes dans les feuilles est supérieur a celle présente dans les graines cela est expliqué par la quantité d’enzyme et d’hormone de nature protéique nécessaire pour les différentes activités métabolique pour la feuille. VIII. Conclusion : L’électrophorèse est une méthode d’analyse fondée sur la migration des espèces chargées sous l’effet d’un champ électrique, elle s’applique dans divers domaines tels que l’industrie, biologie et médecine… Cette technique permet de : Déterminer le nombre de sous unités d’une protéine et de déterminer leur masse molaire respective. D’évaluer le degré de purification d’une protéine. De séparer des protéines pour les révéler par la technique du Western blot (réaction avec un ou des anticorps. De séparer les protéines sur des gels bidimensionnels.
