Université Mohamed Khider -BiskraFaculté des sciences exactes et des sciences de la nature et de la vie Département des sciences de la nature et de la vie 1 er master biochimie fondamental et appliqué - Bendahmane Sabrine Benrouane Sakina Bensalem Ahlem Behaz Imane Ben Achour Mofida Benchnaf Sakina Chouia Amel 2016/2017 1- Introduction 2- Extraction d'ADN du sang 2-1- Protocol d’extraction de l'ADN de sang 3- Extraction d'ADN chez les animaux 3-1- Protocol d’extraction d'ADN de foie de mouton 4- Conclusion L'extraction de l'ADN est une technique permettant d'isoler l'ADN de cellules ou de tissus. L'ADN ainsi extrait peut ensuite être utilisé pour des recherches de biologie moléculaire, telles que la PCR. Il existe différents protocoles pour extraire l'ADN mais le principe est a peu près toujours le même. L'extraction de l'ADN chez les animaux et le sang, sont les deux protocoles en va étudié dans cette travail, alors comment en peut extrait leurs matériel génétique Une première étape consiste à éliminer les globules rouges et toutes les impuretés du milieu extra cellulaire. On ajoute aux prélèvements effectués une solution hypotonique qui fera éclater les globules rouges. Les globules blancs étant beaucoup plus résistants, ils ne seront pas détruits. Comme les globules rouges ne contiennent pas d'ADN, il sera extrait des globules blancs. La centrifugation permet de séparer les globules blancs des débris de globules rouges. A la fin de la centrifugation, il apparaît au fond du tube un « culot » blanc (ce sont les restes de globules blancs) et un « surnageant » rouge (ce sont les débris de globules rouges) que l'on va retirer du tube. La centrifugation se fait à la vitesse de 4000 rpm pendant 5 minutes Pour cette étape, on utilise une solution agressive de détergent afin de déstabiliser la membrane des globules blancs et le noyau de la cellule. Ensuite, une enzyme appelée « Protéinase K » est ajoutée à la solution. Elle va dégrader les protéines de la cellule. Le tube est chauffé entre 55 et 65°C pendant un temps pouvant allé de une heure à une nuit entière, afin d'avoir une activité optimale de la protéinase K. Détergent agressif Protéinase K Culot Suite à cette étape, le tube contient un mélange d'ADN, et les restes de la cellules : fragments de protéines, résidus de la membrane de la cellule et toutes les molécules du cytoplasme. Chauffé entre 55 et 65 °C de 1 heure à toute une nuit Destruction des globules blancs Grâce à la précipitation, on peut séparer l'ADN du reste de la solution de lysat. On ajouté d'abord délicatement de l'isopropanol pur (dit isopropanol 100%) et on mélange délicatement le tube. Après 4 à 5 agitations, on observe la formation d'une masse opaque, sous forme de « pelote » : c'est l'ADN. Ajouté l’isopropanol agitation ADN Le tube doit repasser dans la centrifugeuse. La centrifugation va mettre la pelote d'ADN au fond du tube. Ainsi, on pourra éliminer le surnageant contenant les restes de la cellule sans toucher à l'ADN. centrifugation Éliminé le surnagent Pour éliminer le maximum de la solution de lyse, on ajoute dans le tube de l'éthanol 70%. L'éthanol 70% sera plus efficace que l'isopropanol pour éliminer les restes de la solution de lyse, car il contient 30% d'eau (C'est l'eau qui va solubiliser les impuretés autour de la pelote d'ADN. On centrifuge alors la solution ,afin que la pelote se dépose au fond du tube et permette ainsi d'éliminer plus facilement le surnageant. Cependant, l'éthanol peut fausser les analyses réalisées sur l'ADN ainsi extrait. On laisse donc le tube ouvert pour que l'éthanol s'évapore. Quand l'ADN est en pelote sèche, il ne peut être utilisé pour des analyses de biologie moléculaire. On doit donc réhydraté l'ADN dans une solution. L'ADN sera totalement réhydraté lorsque la pelote aura disparu. La solution est le plus souvent du Tris-EDTA. Ces composants donnent un pH et une force ionique à l'eau qui optimisent l'hydratation et la conservation de l'ADN. Pour une meilleure hydratation de l'ADN, on chauffe le tube à 65°C pendant 1 à 2 heures après l'ajout du Tris-EDTA. Tris- EDTA 2- Extraction d’ADN chez les animaux (cellule animale) 1- on va couper un morceau de foie en 5 parties a peut prés égales. 2-on prépare le milieu d’extraction: 60 ml d’eau déminéralisée On dissous 9 g de NaCl 4 à 5 gouttes d’acide acétique 3-pour obtenir la solution: - On versera dans un mortier 30 ml de cette solution ainsi que les morceaux de foie. 30 ml de solution - On broie alors ces morceaux dans le mortier , mais dans ce broyat seule la phase liquide nous intéresse ( mais ce liquide contient encore des débris de cellules dont on veut débarrasser 3-on va placer le tube ( contente le mélange ) dans un centrifugeuse à 2000 rpm pendant 10 minutes. Après 10 minutes de centrifugation on récupère alors le surnageant 4- on placé un volume de ce surnageant dans un tube, puis on a rajouté deux volumes d’éthanol Éthanol, 2 volumes Surnageant , 1 volume - On incline délicatement de gauche a droite le liquide afin d’obtenir le résultats final ADN Toutes les cellules , animales ou végétales contiennent un pelote blanche filamenteuse ( ADN). http://fr.calameo.com/read/000462342715fc79722ee http://tpe-adn-police-scientifique.e-monsite.com/pages/methode-dextraction-de-l-adn.html http://www.didier-pol.net/3ftextadnfoie.htm https://fr.wikipedia.org/wiki/Eau_d%C3%A9min%C3%A9ralis%C3%A9e http://wiki.scienceamusante.net/index.php?title=Extraction_de_son_propre_ ADN Merci POUR VOTRE ATTENTION
