97 Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 2007, 146, 97-112 INFLUENCE DU 2,4-D ET DE L’EXPLANT EMBRYONNAIRE SUR LA CALLOGENÈSE DU BLÉ DUR (*) Kou toua AYOLIÉ ( 1 ) , Hou da EL YACOUBI Atm ane ROCHDI ( 1 ) (1) , Des explants d’embryons matures ou immatures entiers ou coupés de moitié de variétés marocaines de Blé dur (Triticum durum) ont été cultivés sur le milieu MS supplémenté de différentes concentrations de 2,4-D. Pour l’ensemble des variétés étudiées, les meilleurs taux de croissance de la matière fraîche ont été enregistrés à 3,5 mg/l de 2,4-D avec des taux de germination très faibles. La callogenèse dépend du génotype et est favorisée par l’utilisation d’embryons immatures et leur fragmentation. À 3,5 mg/l de 2,4-D, le taux moyen de callogenèse atteint 64 et 79 % pour les embryons et demi-embryons matures, et 98 et 100 % pour les embryons et demi-embryons immatures. INTRODUCTION Le Blé est essentiellement amélioré par des méthodes traditionnelles qui restent longues et onéreuses. L’obtention de cals par culture in vitro permet une augmentation de la variabilité et peut être suivie d’une régénération et d’un taux élevé de multiplication [13]. [4 ] (*) (1) Manuscrit reçu le 10 juillet 2006. Unité Écophysiologie et Biotechnologie de culture in vitro, Université Ibn Tofaïl, Faculté des Sciences, BP 133, 14000 Kénitra, Maroc. [email protected] 98 Chez le Blé tendre (Triticum aestivum), l’initiation de cals a été généralement réalisée à partir de fragments de feuilles [20], d’inflorescences [15], d’embryons immatures [1,10-11,14] et matures [5,8] avec plus ou moins de succès selon les variétés. La callogenèse du Blé dur (Triticum durum) reste moins maîtrisée et dépend des variétés. La présente étude vise à déterminer les conditions optimales de callogenèse à partir d’embryons matures et immatures de sept variétés de Blé dur en présence de 2,4-D. MATÉRIEL ET MÉTHODES Matériel végétal Sept variétés marocaines de Blé dur (Triticum durum Desf.) ont été utilisées : Amjad (recommandée pour les zones semi-arides), Marzak (tolérante aux principales maladies cryptogamiques), OumRabia (recommandée pour les zones semi-arides et arides), Sebou (résistante à la rouille et tolérante à la septoriose et l’helminthosporiose), Ourgh (d’adaptation très large), Anouar et Tomouh (d’adaptation large). Les semences ont été fournies par l’INRA (Institut National de Recherche Agronomique) de Rabat (Maroc). Les embryons matures ont été prélevés à partir des graines de six variétés (Amjad, Marzak, OumRabia, Ourgh, Sebou, Anouar). Les embryons immatures (1 à 1,5 mm) de trois variétés (Amjad, Marzak et Tomouh) ont été prélevés sur les épis de plantes cultivées sous serre, 2 à 3 semaines après l’anthèse. Désinfection et mise en culture Les caryopses matures et immatures débarrassés de leurs glumes et glumelles sont désinfectés par trempage et agitation, dans de l’éthanol 70° 50 et 30 secondes, puis dans de l’eau de Javel à 25 % 25 et 15 minutes respectivement. Suivent trois rinçages à l’eau distillée stérile sous une hotte 99 à flux laminaire horizontal. Une partie des embryons matures et immatures est sectionnée en deux demi-embryons en divisant le scutellum dans le sens de la longueur. Les explants sont placés face scutellaire vers le haut sur le milieu de culture solide dans des boîtes de Petri de 9 cm de diamètre. Initiation de la callogenèse Le milieu utilisé est celui de Murashige et Skoog (MS) [9 ] supplémenté de différentes concentrations (1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 et 4 voire 5 mg/l) de l’auxine 2,4-D (acide 2,4-dichlorophénoxyacétique). Le pH est ajusté à 5,7 avant autoclavage 20 minutes à 120°C. L’incubation a lieu à l’obscurité à 25 ± 2°C. Pour chaque variété et chaque concentration en 2,4D, trois boîtes de Petri renfermant cinq embryons et cinq demi-embryons, matures ou immatures, sont utilisées. Variables suivies L’aptitude à la callogenèse est évaluée par les paramètres suivants : - L’induction des cals est estimée par le taux de callogenèse, pourcentage d’explants ayant produit un cal après deux semaines de culture pour les embryons immatures et quatre semaines pour les embryons matures. - Certains explants germent et le taux de germination est alors déterminé après deux et quatre semaines respectivement chez les embryons immatures et matures. - Le taux d’accroissement de la masse de matière fraîche du cal après deux semaines pour les embryons immatures et quatre semaines pour les embryons matures est calculé à partir de la différence de masse entre l’explant initial et le cal obtenu, divisée par la masse initiale. Analyse statistique L’analyse de variance a été réalisée par un logiciel de statistique et le test de Student-Newman-Keuls (SNK) a été utilisé pour le classement des moyennes. 100 RÉSULTATS Données générales L’induction des cals a débuté après trois jours de culture chez les embryons immatures et dix jours chez les embryons matures. Les cals provenant d’embryons matures sont jaune clair sauf pour la concentration 5 mg/l 2,4-D ou la coloration est jaune foncé. Ceux provenant d’embryons immatures sont jaune blanchâtre. Les cals présentent également des différences dans la consistance, compacte ou friable et la texture, lisse ou rugueuse (Tableaux I et II). Tableau I : Effet du 2,4-D sur l’initiation des cals (toutes variétés confondues) à partir d’embryons matures après quatre semaines de culture sur le milieu MS à 25°C à l’obscurité. 2,4-D Embryon (mg/l) Induction des cals (%) Germination Taux Consistance, (%) d’accroissement Aspect 23,3 0,4 compact, lisse 27,8 43,3 0,8 compact, lisse 1,5 entier 17,8 2 demi entier 25,6 36,7 2,5 demi entier 54,4 43,3 41,1 36,7 0,9 compact, lisse 3 demi entier demi 53,3 53,3 65,6 27,8 23,3 13,3 1,9 - friable, lisse 3,5 entier demi 66,7 78,9 30,0 8,9 2,7 - friable, rugueux 4 entier demi 65,6 78,9 20,0 6,7 2,6 - friable, rugueux 5 entier demi 38,9 51,1 13,3 3,3 1,6 - friable, rugueux 101 Tableau II : Effet du 2,4-D sur l’initiation de cals (toutes variétés confondues) à partir d’embryons immatures après deux semaines de culture sur le milieu MS à 25°C à l’obscurité. 2,4-D Embryon (mg/l) 1,5 2 2,5 3 3,5 4 entier Induction des cals (%) 100,0 Germination Taux Consistance, (%) d’accroissement Aspect 93,3 0,5 demi 91,1 86,7 - entier 91,1 64,5 1,9 demi 93,3 35,6 - entier 88,9 53,3 2,3 demi 91,1 20,0 - entier 93,3 48,9 2,5 demi 97,8 15,6 - entier 100,0 46,7 2,7 demi 97,8 4,4 - entier 97,8 41,1 2,6 demi 97,8 11,1 - compact, lisse compact, lisse compact, lisse peu friable, lisse peu friable, lisse peu friable, lisse Le taux de germination est plus faible pour les demi-embryons que pour les embryons entiers et il baisse avec la teneur en auxine. En outre, à 1,5 mg/l de 2,4-D, il se forme une longue racine qui tend à disparaître à partir de 3,5 mg/l. Les demi-embryons sont moins enclins à la germination à partir de 3,5 mg/l (Figures 1 et 2). L’induction des cals est importante dès 1,5 mg/l de 2,4-D pour les embryons et demi-embryons immatures alors qu’elle ne dépasse 50 % qu’à partir de 3 mg/l pour les embryons et demi-embryons matures. Cependant, à 3,5 mg/l de 2,4-D, on a une bonne induction de cals de masse importante. 102 Fig. 1 : Callogenèse d'embryons (à gauche des boîtes) et de demi-embryons (à droite des boîtes) immatures de Blé dur après deux semaines de culture sur le milieu MS en présence de 1,5 (photo de gauche) et 3,5 mg/l (photo de droite) de 2,4-D. Fig. 2 : Callogenèse d'embryons (à gauche) et de demi-embryons (à droite) matures de Blé dur après quatre semaines de culture sur le milieu MS en présence de 3,5 mg/l de 2,4-D. Cas des embryons et demi-embryons matures Les variétés étudiées présentent des taux de callogenèse différents aussi bien pour l’embryon entier que pour le demi-embryon mature (Figure 3b). Cette différence met en évidence l’effet génotype. Concernant l’embryon entier, les variétés Anouar, Ourgh, Sebou et OumRabia présentent des taux d’induction de cal supérieurs à 50 % pour toutes les concentrations de 2,4-D utilisées, à l’exception de 1,5 mg/l où les taux oscillent entre 13 et 26 %. Par contre, pour les variétés Amjad et Marzak, les taux de callogenèse n’excèdent 50 % qu’à 3,5 et 4 mg/l pour 103 ‘Amjad’ et 4 mg/l pour ‘Marzak’. La concentration optimale pour l’induction du cal est de 3,5 mg/l pour les variétés Amjad, Sebou, Ourgh et Anouar et de 4 mg/l pour les autres variétés. Concernant le demi-embryon, les taux de callogenèse dépassent toujours 50 % chez la variété Anouar et dans toutes les concentrations de 2,4-D utilisées, excepté 1,5 mg/l chez les variétés OumRabia, Sebou et Ourgh. Par contre, chez ‘Amjad’ et ‘Marzak’, les taux de callogenèse n’atteignent 50 % qu’à 3,5 et 4 mg/l. Callogenèse (%) 100 80 60 40 20 0 Amjad Marzak Oum Rabia Sebou Ourgh Anouar a - Embryons entiers 1,5 Callogenèse (%) 100 2 80 2,5 60 3 40 3,5 4 20 5 0 Amjad Marzak Oum Rabia Sebou Ourgh Anouar b - Demi-embryons Fig. 3 : Variation du taux de callogenèse d’embryons (a) et de demi-embryons (b) matures de six variétés de Blé dur en fonction de la concentration de 2,4-D après quatre semaines de culture sur le milieu MS à 25°C à l’obscurité. Germination (%) 104 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Amjad Marzak Oum Rabia Sebou Ourgh Anouar Germination (%) a - Embryons entiers 1,5 2 2,5 3 3,5 4 5 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Amjad Marzak Oum Rabia Sebou Ourgh Anouar b - Demi-embryons Fig. 4 : Variation du taux de germination à partir d’embryons (a) et de demi-embryons (b) matures lors de la callogenèse de six cultivars de Blé dur en fonction de la concentration de 2,4-D après quatre semaines de culture sur le milieu MS à 25°C à l’obscurité. L’analyse de la variance (Tableau III) révèle des différences très hautement significatives pour l’effet de la concentration en 2,4-D, du génotype et du type d’explant. D’après le test SNK, 3,5 et 4 > 3 > 2, 2,5 et 5 > 1,5 mg/l de 2,4-D, ‘OumRabia’, ‘Anouar’ et ‘Sebou’ > ‘Ourgh’ > ‘Amjad’ et ‘Marzak’ et les demi-embryons donnent de meilleurs résultats que les embryons. Les pourcentages de germination des embryons et demi-embryons varient également selon le génotype (Figure 4a et b). Ils sont les plus élevés chez la variété Sebou (80 et 75 %) et faibles chez ‘Amjad’ et ‘Marzak’. Ils atteignent 50 à 60 % pour les variétés Anouar, Ourgh et OumRabia. 105 Tableau III : Analyse de la variance lors de la callogenèse d’embryons et de demi-embryons de divers cultivars de Blé dur en présence de différentes concentrations de 2,4-D. Variables considérées Source de variation Concentration en 2,4-D F observé Embryons matures Embryons immatures Nombre de Nombre Masse Nombre Nombre Masse cals d’explants fraîche des de cals d’explants fraîche des germés cals germés cals 31,99 *** 14,88 *** 196,42 *** 2,48 * 25,76 *** 125,78 *** Génotype 30,76 *** 37,02 *** 38,88 *** 10,77 *** 3,77 * 4,40 * Type d’explant 29,22 *** 18,70 *** - 0,05 ns 70,74 *** - ns: non significatif ; *** significatif à 1 ‰ ; * significatif à 5 %. Par ailleurs, le taux de germination est généralement plus faible pour les demi-embryons que pour les embryons entiers. L’analyse statistique (Tableau III) met en évidence un effet très hautement significatif de la concentration en 2,4-D et du génotype sur la germination. D’après le test SNK, 5 > 4 > 3,5 > 3 > 1,5 > 2,5 > 2 mg/l de 2,4-D, ‘Amjad’ et ‘Marzak’ > ‘OumRabia’, ‘Anouar’ et ‘Ourgh’ > ‘Sebou’ et les demi-embryons donnent moins de germination que les embryons. La croissance des cals des embryons matures est importante à 3,5 et 4 mg/l de 2,4-D (Figure 5). L’analyse de la variance (Tableau III) montre un effet très hautement significatif de la concentration en 2,4-D et du génotype sur la croissance des cals. D’après le test SNK, 3,5 et 4 > 3 > 5 > 2,5 et 2 > 1,5 mg/l de 2,4-D, ‘Ourgh’ et ‘Sebou’ > ‘OumRabia’ et ‘Anouar’ > ‘Amjad’ et Marzak pour la croissance des cals. 106 Taux de croissance de la matière fraîche des cals 3,5 1,5 2 2,5 3 3,5 4 5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Amjad Marzak Oum Rabia Sebou Ourgh Anouar Variétés Fig. 5 : Variation du taux de croissance des cals induits à partir d’embryons matures de six variétés de Blé dur en fonction de la concentration de 2,4-D après quatre semaines de culture sur le milieu MS à 25°C à l’obscurité. Cas des embryons et demi-embryons immatures 1,5 2 2,5 3 3,5 4 110 110 100 90 80 70 60 50 Callogenèse (%) Callogenèse (%) Le taux de callogenèse des embryons et demi-embrons immatures (Figure 6a et b) est élevé pour toutes les concentrations testées. Il est proche de 100 % pour ‘Amjad’ et ‘Tomouh’ et de 80 % pour ‘Marzah’. 100 90 80 70 60 50 Amjad Marzak Tomouh a - Embryons entiers Amjad Marzak Tomouh b - Demi-embryons Fig. 6 : Variation du taux de callogenèse d’embryons (a) et de demiembryons (b) immatures de trois cultivars de Blé dur en fonction de la concentration de 2,4-D après deux semaines de culture sur le milieu MS à 25°C à l’obscurité. 107 L’analyse de la variance (Tableau II) révèle un effet significatif de la concentration de 2,4-D et du génotype, mais pas pour le type d’explant. D’après le test SNK, 3,5 > 4 > 1,5 et 3 > 2 > 2,5 mg/l de 2,4-D, ‘Tomouh’ et ‘Amjad’ > ‘Marzak’ pour l’induction de cals. Les taux de germination après deux semaines de culture (Figure 7) sont plus importants chez l’embryon entier que le demi-embryon. Les taux les plus élevés (> 80 %) sont observés aux faibles concentrations. Le taux est supérieur à 50 % avec l’embryon de la variété Tomouh. Les plus faibles taux ont été observés à 3,5 mg/l avec le demi-embryon pour ‘Amjad’ et ‘Marzak’. 100 80 Callogenèse (%) Callogenèse (%) 100 60 40 20 0 Amjad Marzak Tomouh a - Embryons entiers 80 1,5 60 2 2,5 40 3 20 3,5 4 0 Amjad Marzak Tomouh b - Demi-embryons Fig. 7 : Variation du taux de germination d’embryons (a) et de demiembryons (b) immatures lors de la callogenèse de trois cultivars de Blé dur en fonction de la concentration de 2,4-D après deux semaines de culture sur le milieu MS à 25°C à l’obscurité. L’analyse de la variance montre un effet très hautement significatif de la concentration en 2,4-D et du type d’explant sur la germination (Tableau III). D’après le test SNK, 4, 3,5 et 3 et 2,5 > 2 > 1,5 mg/l de 2,4-D et ‘Amjad’ et ‘Marzak’ > ‘Tomouh’. Le taux de croissance de la masse de matière fraîche des cals après deux semaines de culture augmente avec la concentration de 2,4-D (Figure 8) et atteint 380 % à 3,5-4 mg/l. Ce taux de croissance reste relativement important pour les autres concentrations à l’exception d’1,5 mg/l. 108 Taux de croissance de la matière fraîche des cals L’analyse de la variance (Tableau III) a montré un effet très hautement significatif de la concentration en 2,4-D sur la croissance du cal à partir d’embryons immatures entiers. D’après le test SNK, 3,5 > 4 > 3 > 2,5 > 2 > 1,5 mg/l de 2,4-D, ‘Marzak’ > ‘Amjad’ et ‘Tomouh’. 1,5 2 2,5 3 3,5 4 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Amjad Marzak Oum Rabia Variétés Fig. 8 : Variation du taux de croissance des cals de trois cultivars de Blé dur en fonction de la concentration de 2,4-D après deux semaines de culture sur le milieu MS à 25°C à l’obscurité. DISCUSSION ET CONCLUSION Chez le Blé tendre, la callogenèse a été induite en présence du 2,4-D seul ou en combinaison avec une deuxième auxine, l’ANA [19]. Dans cette étude, le 2,4-D seul a été suffisant pour l’induction et la croissance des cals chez plusieurs variétés de Blé dur. L’influence de la concentration en 2,4-D et des embryons ou demiembryons comme explants a été mise en évidence. Ainsi, les cals sont induits à toutes les concentrations testées, avec un meilleur taux de callogenèse à 3,5 et 4 mg/l. Dans d’autres travaux, des cals ont été obtenus à des concentrations plus faibles de 2,4-D (1 mg/l chez le Blé tendre [7] ; 1,5 [2] ou 2 mg/l chez le Blé dur [12 ]) ou beaucoup plus élevées (6 et 8 mg/l [3]). La croissance des cals a presque quadruplé à 3,5 et 4 mg/l de 2,4-D alors que le taux de germination est faible. L’utilisation d’embryons immatures a permis l’amélioration de la callogenèse in vitro chez le Blé [11]. L’induction callogène chez les explants immatures en seulement trois jours pourrait être due à la fragilité de leurs structures membranaires permettant ainsi une pénétration rapide de l’auxine. [17-18] 109 La pénétration pourrait aussi être favorisée en coupant l’embryon. Certains auteurs estiment que le niveau endogène de régulateur de croissance relativement important chez les embryons immatures explique la formation rapide de cals surmontés souvent de jeunes pousses [10 ]. Le niveau de phytohormones endogènes serait par contre très faible chez l’embryon mature [16], ce qui est à mettre en rapport avec les dix jours d’incubation nécessaires au déclenchement de la callogenèse. Du présent travail, il ressort également que le problème de la germination se pose beaucoup plus aux faibles concentrations de 2,4-D, notamment pour les explants non sectionnés. L’expression de la compétence morphogénétique in vitro est complexe et influencée par des facteurs physiologiques et d’ordre génétique. Ainsi, l’effet du cultivar a été significatif sur la formation du cal en accord avec d’autres travaux [6] effectués sur le Blé dur. En définitive, la callogenèse dépend du génotype, du type d’explant et de la concentration en 2,4-D. Si l’embryon immature n’est disponible que pendant une période très courte du cycle végétatif du Blé, son utilisation permet une nette amélioration de l’aptitude à la callogenèse. La fragmentation des explants embryonnaires améliore la callogenèse et évite une germination. RÉFÉRENCES 1- Arzani (A.), Mirodjagh (S.S.) - Response of durum wheat cultivars to immature embryo culture, callus induction and in vitro salt stress. 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